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高尔基体磷酸化蛋白3(Golgi phosphoprotein 3,GOLPH3),是一种新发现的分子量为34k Da的磷酸化基质蛋白,位于高尔基复合体成熟面,在高尔基体囊泡分泌和DNA损伤修复中起重要作用。近期研究表明,GOLPH3在多种恶性肿瘤中高表达,且与肿瘤的增值侵袭及预后不良密切相关。但是GOLPH3在上皮性卵巢癌中的生物学作用及其分子作用机制仍知之甚少。因此,在此次研究中,我们想确定GOLPH3是否参与了上皮性卵巢癌的侵袭转移过程,同时探究其发生的分子学机制。研究中我们发现,相对于正常卵巢组织和细胞株(MOODY),GOLPH3在上皮性卵巢癌临床标本和细胞株(SKOV3,HEY)中明显高表达。同时,利用小干扰RNA和过表达质粒分别沉默和增高GOLPH3表达,通过Transwell和划痕技术,我们发现GOLPH3促进上皮性卵巢癌细胞发生侵袭转移。上皮间质转化(epithelial–mesenchymal transition,EMT)是多种恶性肿瘤侵袭转移过程的关键步骤,调节于多种信号通路如Wnt/β-catenin信号通路。研究结果显示,GOLPH3可以促进N-cadherin和Snail及抑制E-cadherin表达,同时,利用Wnt信号通路阻滞剂机或激动剂可以逆转或增强GOLPH3诱导的上皮性卵巢癌细胞EMT过程,表明GOLPH3可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进EMT使上皮性卵巢癌细胞发生侵袭转移。研究中我们还发现,DNA损伤修复相关基因,EDD,在上皮性卵巢癌组织和细胞株中随GOLPH3表达增高,同时可以激活Wnt信号通路促进上皮性卵巢癌细胞发生EMT。因此我们推断GOLPH3通过介导EDD在上皮性卵巢癌细胞中发挥作用。总之,我们研究证实,GOLPH3可以通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进上皮性卵巢癌细胞发生EMT进而发生侵袭转移,GOLPH3很可能成为上皮性卵巢癌新的治疗靶点。第一部分GOLPH3在上皮性卵巢癌中高表达目的:检测GOLPH3在上皮性卵巢癌临床组织和细胞系中的表达水平。方法:利用免疫组化技术,分别检测GOLPH3在良性卵巢肿瘤、交界性卵巢肿瘤及上皮性卵巢癌组织标本中的表达。正确培养上皮性卵巢癌细胞株SKOV3、HEY、ES-2、HO8910、HO8910-PM和正常永生卵巢上皮细胞MOODY,并分别提取其蛋白及RNA。通过Western Blot和q RT-PCR检测技术,分别检测GOLPH3在不同细胞株中的表达情况。结果:(1)在卵巢良性肿瘤、卵巢交界性肿瘤及上皮性卵巢癌临床组织标本中,GOLPH3呈依次表达递增的趋势,在上皮性卵巢癌中呈强阳性,且其表达主要位于细胞质。(2)q RT-PCR和Weatern Blot检测结果表明,GOLPH3在上皮性卵巢癌细胞株SKOV3、HEY及HO8910-PM中高表达,并明显高于正常永生卵巢上皮细胞MOODY,其中以在HEY和SKOV3细胞株中表达最强,而在HO8910细胞株中表达最弱。结论:GOLPH3在上皮性卵巢癌中高表达。第二部分GOLPH3诱导上皮性卵巢癌发生细胞上皮间质转化目的:研究GOLPH3在上皮性卵巢癌发生侵袭和上皮间质转化过程中的作用。方法:利用小干扰RNA技术分别沉默SKOV3和HEY细胞株中GOLPH3基因的表达,同时利用过表达质粒使HO8910细胞株中GOLPH3基因表达增高,通过qRT-PCR和Western Blot技术检测其转染效率。应用Transwell和划痕技术检测各处理细胞株侵袭迁移能力变化。利用Western Blot技术检测各处理细胞中上皮间质转化相关蛋白E-cadherin,N-cadherin以及Snail的表达情况。结果:(1)Western Blot及q RT-PCR结果显示,在小干扰RNA沉默SKOV3和HEY细胞中GOLPH3的表达明显下降,而过表达质粒转染的HO8910细胞中GOLPH3表达明显增高。(2)Transwell侵袭实验和迁移实验结果表明,沉默GOLPH3表达后,迁移和侵袭到滤过膜的细胞数量明显减少,而过表达GOLPH3后,迁移和侵袭到滤过膜的细胞数量明显增多。(3)划痕实验结果显示,干扰GOLPH3表达,细胞迁移能力明显下降,而增高GOLPH3表达,细胞迁移能力增强。(4)Western Blot检测结果表明,在HEY和SKOV3细胞中沉默GOLPH3可以促进E-cadherin的表达,抑制N-cadherin,Snail的表达,而在HO8910过表达GOLPH3细胞中出现相反情况。结论:GOLPH3具有增强上皮性卵巢癌细胞侵袭和促进其发生上皮间质转化的作用。第三部分GOLPH3通过激活Wnt/β-catenin通路诱导上皮性卵巢癌细胞发生上皮间质转化目的:探究GOLPH3促进上皮性卵巢癌细胞发生上皮间质转化的作用机制。方法:用小干扰RNA分别沉默上皮性卵巢癌细胞株HEY和SKOV3中GOLPH3基因的表达,利用过表达质粒增强上皮性卵巢癌细胞株HO8910中GOLPH3基因的表达。应用Western Blot技术检测各处理细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin,c-Myc和cyclin-D1的表达。使用Wnt/β-catenin信号通路激动剂Li Cl和阻滞剂XAV939,分别处理沉默GOLPH3的卵巢癌细胞HEY和过表达GOLPH3的卵巢癌细胞HO8910。利用Western Blot技术检测各处理细胞中Wnt/β-catenin信号通路以及上皮间质转化(EMT)相关蛋白的表达情况。结果:(1)Western Blot结果显示,在HEY和SKOV3卵巢癌细胞中,沉默GOLPH3基因表达,β-catenin,c-Myc和cyclin-D1的表达均明显下降,而在HO8910卵巢癌细胞中,过表达GOLPH3,β-catenin,c-Myc和cyclin-D1的表达均明显升高。表明GOLPH3可以激活Wnt/β-catenin信号通路。(2)在HEY和HO8910处理细胞中,使用Wnt/β-catenin信号通路激动剂Li Cl或阻滞剂XAV939后,EMT相关蛋白发生明显上升或下降,表明EMT过程发生增强或逆转。结论:GOLPH3可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促使上皮性卵巢癌细胞发生上皮间质转化。第四部分EDD参与GOLPH3诱导的上皮性卵巢癌细胞上皮间质转化过程目的:探讨EDD与GOLPH3之间的作用关系,同时探究EDD在GOLPH3促进上皮性卵巢癌细胞上皮间质转化过程中的作用及其机制。方法:利用免疫组化技术,分别检测GOLPH3及EDD在良性卵巢肿瘤、交界性卵巢肿瘤及上皮性卵巢癌组织标本中的同标本同区域表达情况。分别利用Western Blot和q RT-PCR技术检测EDD在沉默GOLPH3基因的HEY细胞及过表达GOLPH3基因的HO8910细胞中的表达水平。应用小干扰RNA技术,沉默上皮性卵巢癌细胞HEY中EDD的表达。利用Western Blot技术检测沉默EDD基因的HEY细胞中EMT及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达。结果:(1)免疫组化结果显示,在卵巢良性肿瘤、卵巢交界性肿瘤及上皮性卵巢癌临床组织标本中,EDD随GOLH3呈依次表达递增趋势,在上皮性卵巢癌中两者均呈强阳性,且GOLPH3表达主要位于细胞质,EDD表达主要位于细胞核。(2)Western Blot和q RT-PCR结果表明,在干扰GOLPH3的卵巢癌细胞HEY中,EDD表达下降,而在过表达GOLPH3的卵巢癌细胞HO8910中,EDD表达升高。(3)利用小干扰RNA沉默HEY细胞中EDD的表达,通过Western Blot实验结果表明,EMT相关蛋白N-cadherin,Snail表达升高,E-cadherin表达降低,Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin,c-Myc和cyclin-D1表达均明显下降。结论:EDD可能作为GOLPH3的下游基因,参与其促进上皮性卵巢癌细胞上皮间质转化的过程。