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背景:缺血性心脏病可导致不可逆转的心肌损伤,并最终导致心力衰竭,是世界范围内死亡的主要原因。及时的恢复血流灌注可挽救缺血心肌,但再灌注本身也可加重缺血造成的损伤,这一概念被称为心肌缺血再灌注(I/R)损伤。瑞芬太尼是一种超短效的μ阿片受体激动药,具有镇痛效果确切、起效迅速、作用时间短、无蓄积且较少受年龄影响等优点,因而广泛用于临床麻醉,尤其是心血管麻醉。大量基础和临床研究表明瑞芬太尼后处理(RPC)可模拟缺血后处理,减轻心肌I/R损伤,发挥强大的心肌保护作用。近年来,越来越多的研究表明自噬广泛参与心肌I/R损伤的发生发展,且自噬在缺血阶段和再灌注阶段起着不同的作用;大多数学者认为缺血期间适度的自噬可保护心肌,而再灌注期间过度的自噬和受损的自噬流则对心肌不利。因而恢复再灌注期间受损的自噬流成为减轻心肌I/R损伤的一个潜在治疗靶点。既往研究已证实缺血后处理在再灌注早期可激活自噬并促进受损的自噬流,发挥抗I/R损伤的心肌保护作用。由于RPC可模拟缺血后处理减轻心肌I/R损伤,因此我们推测自噬可能也参与了RPC的抗I/R损伤的心肌保护作用。本研究拟探讨RPC是否可促进再灌注期间受损的自噬流,从而发挥心肌保护作用。实验目的:1.在体水平研究RPC对大鼠心肌I/R损伤后再灌注期间自噬流的影响,验证自噬是否参与RPC的心肌保护作用;2.细胞水平观察RPC对H9c2心肌细胞缺氧复氧(H/R)损伤引起自噬的影响,并通过加入自噬抑制剂和ATG7基因敲低技术进一步验证自噬是否参与RPC抗H/R损伤的保护作用。实验方法:本实验研究内容分为两部分。1.第一部分:研究RPC是否通过激活自噬并促进自噬流发挥抗心肌I/R损伤的保护作用。健康成年雄性SD大鼠,建立在体心肌I/R损伤动物模型,通过左冠状动脉前降支结扎和开放实现心肌的缺血和再灌注。在缺血25min至再灌注开始最初5min时经右颈内静脉持续泵注瑞芬太尼10μg/kg/min实现RPC。为探讨再灌注早期RPC是否会激活自噬并促进自噬流,于再灌注30min时用免疫荧光技术观察大鼠心肌组织中LC3点聚集数,LC3与LAMP2的融合情况,Western blot检测自噬标记蛋白LC3Ⅱ和p62的表达水平。为检测RPC减轻大鼠心肌I/R损伤的保护作用是否与自噬相关,在手术开始前1 h经腹腔注射自噬抑制剂CQ 10 mg/kg,再灌注120min时用免疫荧光观察大鼠心肌组织中LC3点聚集数,Western blot检测大鼠心肌组织中LC3Ⅱ、p62、Beclin 1、LAMP2和Cleaved caspase3蛋白表达情况,并于再灌注结束时用化学发光法检测大鼠血清中肌钙蛋白I(c Tn I)的浓度,TTC染色法检测大鼠心肌梗死体积(IS)。2.第二部分:研究RPC在复氧阶段是否通过激活自噬并促进完整的自噬流发挥抗H/R损伤的心肌保护作用。正常培养H9c2心肌细胞,建立H/R损伤细胞模型,复氧即刻给予1μM的瑞芬太尼实现RPC。免疫荧光观察复氧1 h细胞内LC3点聚集数,自噬体与溶酶体的融合情况,Western blot检测复氧不同时间LC3Ⅱ的表达水平。为进一步验证RPC的心肌保护作用是否与自噬相关,复氧阶段给予RPC的同时加入自噬抑制剂Baf和CQ,免疫荧光观察LC3点聚集数,Western blot检测细胞内LC3Ⅱ、p62、Beclin1、LAMP2和Cleaved caspase 3蛋白表达,CCK-8检测细胞活力,HO/PI染色检测细胞凋亡。此外,用ATG7 sh RNA慢病毒载体感染心肌细胞以敲低细胞内ATG7基因的表达,并进一步验证RPC的心肌保护作用是否与自噬相关。研究结果:第一部分:RPC对大鼠心肌I/R损伤引起自噬的影响。1.再灌注30min时,与Sham组比较,I/R30min组LC3点聚集数明显增加,LC3Ⅱ和p62的蛋白表达水平也明显升高,但自噬体与溶酶体的融合率却显著下降;而与I/R30min组相比,I/R+RF30min组LC3点聚集数和LC3Ⅱ蛋白表达水平进一步增加,自噬体与溶酶体的融合率升高,p62蛋白表达水平却显著下降,表明RPC在再灌注早期可启动自噬并促进自噬流。2.再灌注120 min时,与I/R组比较,I/R+RF组LC3点聚集数明显减少,LC3Ⅱ、p62和Beclin 1蛋白表达水平明显下调,而LAMP2的表达水平却显著上调;I/R+CQ组LC3点聚集数,LC3Ⅱ、p62、Beclin 1和LAMP2蛋白表达水平与I/R组相比无显著差异;但与I/R+RF组相比,I/R+RF+CQ组LC3点聚集数明显增加,LC3Ⅱ、p62和Beclin 1蛋白表达水平明显升高,而LAMP2的表达水平却显著下降。3.与I/R组比较,I/R+RF组心肌IS缩小,血清c Tn I浓度降低,心肌组织Cleaved caspase 3蛋白表达水平降低;I/R+CQ组心肌IS、c Tn I浓度和Cleaved caspase 3蛋白表达较I/R组未发生明显变化;但CQ可取消RPC的心肌保护作用,表现为与I/R+RF组相比,I/R+RF+CQ组心肌IS扩大,c Tn I浓度升高,Cleaved caspase 3蛋白表达水平增加。结果表明自噬参与RPC介导的抗心肌I/R的心肌保护作用。第二部分:RPC对H9c2心肌细胞H/R损伤引起自噬的影响。1.与HR0h组相比,HR1h组LC3点聚集数增加,LC3Ⅱ蛋白表达增加,LC3与LAMP2的融合率下降;与HR+RF0h组比较,HR+RF1h组LC3点聚集数增加,LC3Ⅱ蛋白表达增加,LC3与LAMP2的融合率升高;更为重要的是与HR1h组相比,HR+RF1h组LC3点聚集数和LC3Ⅱ蛋白表达水平均进一步增加,LC3与LAMP2的融合率明显升高。2.HR1h组、HR2h组和HR4h组LC3Ⅱ蛋白表达水平无明显差异,但给予RPC后LC3Ⅱ的蛋白表达水平在复氧1 h时显著增加,而在复氧4 h时却显著下降;此外,与HR1h组比较,RPC使HR+RF1h组LC3Ⅱ的蛋白表达水平明显升高,而在复氧4 h其蛋白表达水平又明显低于HR4h组;表明H/R损伤可损害自噬流,而RPC可增加自噬体的生成并促进自噬体的降解。3.复氧4 h,与CON组比较,HR组LC3点聚集数明显增加,LC3Ⅱ、p62和Beclin 1蛋白表达水平明显升高,而LAMP2的表达水平却显著下降;HR+Baf组和HR+CQ组上述指标变化与HR组相当;与HR组相比,HR+RF组LC3点聚集数明显减少,LC3Ⅱ、p62、Beclin 1的表达水平明显下调,而LAMP2的表达水平却明显上调;但Baf和CQ可取消RPC对上述指标的逆转作用。4.与CON组比较,HR组细胞活力下降,细胞凋亡和Cleaved caspase 3蛋白表达升高;而与HR组相比,HR+RF组细胞活力明显升高,细胞凋亡明显下降且Cleaved caspase 3蛋白表达水平显著下调,表明RPC可减轻心肌细胞H/R损伤;但Baf和CQ可取消RPC的心肌保护作用。5.ATG7基因敲低也会取消RPC的心肌保护作用,表现为与ATG7 sh RNA HR组相比,ATG7 sh RNA HR+RF组细胞活力未明显增加,细胞凋亡和Cleaved caspase 3的表达未显著降低。研究结论:1.RPC在再灌注早期可激活自噬并促进自噬体与溶酶体的融合;2.RPC可上调LAMP2蛋白的表达,恢复溶酶体的功能并促进自噬体与溶酶体的融合,增强I/R损伤后受损的自噬流;3.自噬参与RPC介导的抗I/R损伤的心肌保护作用。