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1,3-丙二醇(1,3-PD)和2,3-丁二醇(2,3-BD)均是重要的化工原料,它们在聚酯合成领域有很好的应用前景。在微生物产生1,3-丙二醇的同时,会产生2,3-丁二醇、乳酸、乙醇等副产物。多产物抑制现象(multipleproductsinhibition)是造成1,3-丙二醇产量和甘油转化率低,后提取困难的主要原因,切断对1,3-丙二醇产生不利的副产物的产生途径有望提高1,3-丙二醇产量和甘油转化率,并简化后提取工艺。
本文研究了通气量对KlebsiellaoxytocaM5al产生1,3-丙二醇的影响,确定了通0.4vvm的空气是其产生1,3-丙二醇的最适通气量。通过分析各副产物对1,3-丙二醇生成带来的影响,提出了提高1,3-丙二醇发酵效率的方法—减少乳酸和乙醇的产量。
通过同源重组的手段构建得到了4株产乳酸途径中ldhA基因插入缺失突变株,突变株的乳酸脱氢酶活性比亲株大幅度降低,突变株LDH1的酶活最高,为亲株的6.92%,LDH3的酶活最低,为亲株的3.65%。将突变株LDH3应用于1,3-丙二醇发酵,在厌氧条件下,所能达到的1,3-丙二醇浓度、甘油的转化率和生产强度较野生型菌株依次提高了45%、29%和32%;在微氧条件下,所能达到的1,3-丙二醇浓度、甘油的转化率和生产强度较野生型菌株依次提高了58%、22%和21%;且在发酵过程中都不产生乳酸。此外,高价值副产物2,3-丁二醇的浓度在厌氧和微氧条件下分别比野生型菌株提高了73%和39%。
在发酵初始添加10gl-1蔗糖可以最大程度提高1,3-丙二醇的生产强度;以8∶1(甘油:蔗糖)的比例补料可以最大程度提高甘油转化率。用突变株LDH3结合微氧和添加蔗糖的补料批式发酵,1,3-丙二醇浓度、甘油转化率和生产强度比最初的野生型厌氧发酵依次提高了113%、51%和122%,2,3-丁二醇浓度提高了10倍以上。
通过同源重组的手段得到了6株产乙醇途径中多效基因adhE插入缺失突变株,突变株乙醛脱氢酶活性均为亲株的10%以下,其中突变株ADH5的活性最低,仅为亲株酶活的4.18%;6个突变株的乙醇脱氢酶活性相差不大,均为亲株酶活的10%左右。将突变株ADH5应用于发酵中,与野生型菌株相比,甘油转化率有所提高,但1,3-丙二醇浓度和生产强度却降低了,这是因为在底物和还原力的竞争中,1,3-丙二醇途径明显弱于乳酸途径所致。过量表达1,3-丙二醇途径中甘油脱水酶的基因dhaB和阻断乳酸产生途径有望改变这种不利状况。
将突变株ADH5和LDH3应用于2,3-丁二醇发酵,在批式发酵中,突变株ADH5的产物浓度、葡萄糖的转化率和生产强度依次比K.oxytocaM5al提高了36%、15%和39%;突变株LDH3的产物浓度、葡萄糖转化率和生产强度依次比K.oxytocaM5al提高了40%、17.5%和46%。