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中国大陆于1994年在广东省首次报道并分离得到H9N2亚型禽流感病毒,随后该亚型病毒广泛传播至我国大部分省区。近年来,关于H9N2亚型禽流感病毒的分离报道呈持续上升态势,该病的流行每年都给我国养禽业带来巨大经济损失。同时H9N2亚型禽流感病毒还可以为新出现感染人的H7N9、H10N8亚型禽流感病毒提供内部基因,潜在威胁人类健康安全,具有重要的经济和公共卫生意义。为弄清H9N2病毒在我国的流行变异情况,本研究对2012~2015年分离到的42株H9N2亚型AIV进行全基因组测序和遗传进化树构建,并选取其中的18株代表株制备单因子血清,进行交叉HI试验,以此来研究H9N2流行株之间的抗原性分化情况,最后用免疫保护实验,评价毒株Ck/GX/SIC6/13对流行株的免疫保护效果。遗传进化分析表明:42株H9N2病毒均属于Ck/Bei-like分支(h9.4.2),其中97.6%(41/42)的分离株属于h9.4.2.5亚分支,2.4%(1/42)的分离株属于h9.4.2.6亚分支,其HA基因之间的核苷酸相似性为86.7%~99.7%,与经典疫苗株的相似性为88.6%~92.6%。分离株形成4种不同的重组基因型(S,U,V,W),基因型S是流行的主基因型,占研究毒株的92.8%(39/42);基因型V、W为新重组基因型,其中基因型V和基因型W分别整合了来源于G9-like谱系的NA基因和wild waterfowl-like谱系的PB2基因,使H9N2病毒的基因重组现象愈加复杂化。特定氨基酸位点分析表明:所有分离株的HA蛋白裂解位点有两种模式,分别为PSRSSR↓GLF(97.6%,41/42)和PARSSR↓GLF(2.4%,1/42),没有多个连续碱性氨基酸插入,均符合低致病性禽流感病毒的分子特征。部分毒株的HA受体结合位点模式与人流感病毒受体结合位点类似,92.8%(39/42)的毒株在HA蛋白上出现了与哺乳动物适应性相关的Q226→L突变;95.2%(40/42)的病毒在NA茎部出现了与毒力增强相关的63-65位点三个氨基酸缺失;97.6%(41/42)的毒株M2蛋白发生了与金刚烷等药物耐药性相关的S31→N突变;本研究分离株中仅有2.4%(1/42)的毒株在PB2基因中出现E627→K,没有D701→N突变出现。交叉HI试验结果表明:18株新分离株单因子抗血清对于相同和不同病毒抗原的HI效价差异为0~9 log2,它们之间的抗原相关性R值为0.41~1,说明即使来源同一分支的H9N2亚型AIV,其抗原性也正在逐渐分化,抗原性差异各异的流行株同时存在给该病的防控带来困难。本研究根据遗传进化树和交叉HI实验结果,将18株新分离株分为3个抗原群(A、B、C),结合HA基因进化分支和毒株分离时间及地点等因素,3个抗原群的出现大致呈现出A→B→C的先后关系。免疫保护实验表明:H9N2早期分离株制备的灭活疫苗对现今H9N2流行毒株不能起到有效保护,对A群病毒的保护率仅为30%~50%;毒株Ck/GX/SIC6/13制备的灭活疫苗也只能保护本毒株的攻毒,保护率为90%,而对其余毒株的保护效果均不理想,提示近年H9N2流行毒株的流行变异较为频繁,流行株之间的抗原性复杂、交叉保护力差。