第一章FANCI基因在POI发病中的作用及机制研究背景早发性卵巢功能不全（Premature ovarian insufficiency,POI）是指女性40岁之前出现卵巢功能衰退,表现为月经紊乱,血清促性腺激素水平升高和雌激素缺乏。POI病因高度异质,包括遗传因素、免疫因素、感染和医源性因素等。其中,遗传因素在POI发病中具有重要作用,目前研究发现约20～25%的POI病因与遗传缺陷有关。近年来通过全外显子组测序（Whole exome sequencing,WES）等技术发现了许多新的POI致病基因,主要集中在DNA损伤修复、同源重组和减数分裂等过程,说明DNA损伤修复缺陷是导致POI发生的重要原因。尽管POI致病基因在不断增加,但这只是POI病因学的冰山一角,半数以上的POI患者病因仍不清楚,寻找新的致病基因并阐明致病机制一直是POI病因学研究的热点和难点。范可尼贫血（Fanconi anemia,FA）通路是经典的DNA损伤修复通路,参与DNA交联损伤（Interstrand cross-links,ICLs）修复和复制叉稳定性的维持。目前,以FA命名的基因有22个（FANCA-W）。多个FA基因缺陷小鼠出现POI样表型,且在 POI 患者中发现了FANCD1/BRCA2、FANCM和FANCU/XRCC2等基因的致病突变,表明FA家族基因可能在卵巢的发育和功能维持中具有重要作用。FANCI是FA通路的重要成员,E3泛素连接酶FANCL与泛素结合酶UBE2T相互协作,促进FANCI-FANCD2复合体的泛素化修饰是FA通路激活的关键节点事件。另外,大样本全基因组关联研究发现FANCI基因与自然绝经年龄、早绝经和POI均有明显相关性。因此,我们推测FANCI基因可能参与卵巢发生发育和功能维持,但其确切功能和作用机制还有待阐明。目的本研究利用Fanci基因敲除小鼠探究FANCI在卵巢发育和功能维持中的作用,借助POI患者WES数据筛查FANCI基因变异情况,并进一步分析变异对蛋白功能的影响,从动物模型和致病变异两方面阐明FNCI基因在POI发病中的作用和机制。方法通过CRISPR/Cas9技术在Fanci基因的第5外显子敲除98bp,造成移码突变和蛋白截短,构建Fanci基因敲除小鼠;通过雌鼠生育力测试、动情周期观察、血清性激素测定和卵巢组织学分析,明确Fanci基因敲除对卵巢功能的影响;通过胚胎性腺观察和生殖细胞计数,明确Fanci缺失对早期生殖细胞发生发育的影响。通过对原始生殖细胞（Primordial germ cell,PGC）凋亡、增殖、细胞周期、DNA损伤的检测,确定Fanci基因在PGC发育和基因组稳定性维持中的作用。在胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblast,MEF）中探讨FANCI维持基因组稳定性的机制,使用丝裂霉素（Mitomycin,MMC）诱导ICLs,阿菲科林（Aphidicolin,APH）和羟基脲（Hydrouria,HU）诱导复制压力,Western blot检测细胞复制压力反应和DNA损伤的指标,DNA fiber assay检测复制叉的稳定性,彗星实验和微核形成率检测评估基因组的稳定性,从而阐明FANCI参与ICLs修复和维持基因组稳定性的机制。在特发性POI患者WES数据中筛选FANCI基因变异,用sanger测序和10 X genomics测序对变异位点及单倍型进行验证,并对变异位点的致病性进行生物信息学分析,明确FANCI基因突变在人POI发病中的作用。结果一、Fanci基因敲除导致小鼠原始生殖细胞发育异常基因型鉴定和蛋白水平验证Fanci基因敲除小鼠。Fanci-/-小鼠生长发育无明显改变,出生比例符合孟德尔遗传定律。成年Fanci-/-雌鼠生育力丧失,动情周期消失,血清FSH明显升高,卵巢萎缩无卵泡,出现POI样表型。3天龄Fanci-/-雌鼠卵巢中原始卵泡和雄鼠睾丸中精原细胞明显减少,提示胚胎期生殖细胞发育异常。进一步观察Fanci-/-胚胎性腺并计数PGC,发现Fanci-/-胚胎PGC在胚胎9.5天（E9.5）已有减少,E11.5时减少更为明显,PGC倍增时间明显延长。但是Fanci-/-胚胎PGC迁移不受影响,性腺中体细胞的发育未见明显异常。二、FANCI在原始生殖细胞发育中的作用机制研究E11.5Fanci-/-胚胎PGC中Cleaved PARP1阳性细胞比例升高,说明凋亡细胞比例增加;EdU掺入细胞比例明显降低,提示PGC增殖能力明显下降;Cyclin B1细胞浆强阳性细胞比例增加,提示PGC出现明显的G2期阻滞。Fanci-/-胚胎S期PGC中FANCD2 foci明显减少并且表达量降低,提示FA通路活化障碍。Fanci-/-胚胎 PGC 中 DNA 双链断裂标志物（Double strand break,DSB）γH2AX foci、53BP1 foci以及磷酸化p53阳性细胞比例明显升高,表明DNA损伤增加及p53激活,以上结果说明Fanci基因敲除造成胚胎PGC中FA通路失活和DNA损伤聚集。MMC和APH处理体外培养MEF诱导ICLs和复制压力后,Fanci--MEF中FANCD2泛素化修饰缺失且表达下降,γH2AX、磷酸化RPA2、磷酸化p53表达升高,53BP1阳性细胞明显增加,提示Fanci基因敲除造成FA通路激活障碍,ICLs修复异常和复制压力解除障碍,导致DNA损伤增加和p53激活。APH和HU诱导复制压力引起Fanci-/-MEF细胞中新生DNA链长度明显缩短,说明Fanci缺失引起复制叉不稳定,新生DNA链异常切除。同时,APH和HU处理后,Fanci-/-MEF细胞彗星尾显著延长,微核形成率升高,说明复制压力导致Fanci-/-MEF细胞基因组不稳定性增加。三、FANCI基因在POI患者中的突变分析在1030例中国汉族特发性POI患者中发现2例患者携带FANCI基因新发复合杂合突变 c.158-2A>G/c.959A>G（p.Q320R）和 c.97C>T（p.L33F）/c.1865C>T（p.S622L）。Minigene实验检测结果显示,c.158-2A>G突变导致剪切异常,造成移码和蛋白截短（p.S54Pfs*5）。生物信息学分析发现,4个突变位点的氨基酸在物种间均高度保守,并且位于FANCI的重要功能域上,多个功能预测软件综合分析4个突变位点均可能是致病变异,说明FANC1基因突变可能导致POI的发病。结论（1）FANCI参与ICLs修复和复制叉稳定性的维持,在卵巢发育和功能维持中具有重要作用。（2）FANCI缺失导致FA通路激活障碍,ICLs修复异常和复制叉不稳定,DNA损伤增加,引起PGC细胞周期异常和增殖降低,卵泡生成不足并过早耗竭。（3）FANCI基因突变可能是POI的发病原因。第二章FANCL基因突变在POI发病中的作用及机制研究背景DNA损伤修复相关基因缺陷在POI遗传学病因研究中受到越来越多的关注。FA通路是经典的DNA损伤修复通路,主要参与ICLs修复。最近研究表明FA基因变异参与POI的发病,提示FA通路对卵泡发生发育及卵巢功能维持具有重要作用。FANCI-D2复合体的单泛素化修饰是ICLs修复过程中的重要节点,E3泛素连接酶FANCL功能受损导致FANCI-D2不能发生泛素化修饰,FA通路将不能被激活。Fancl-/-小鼠胚胎期PGC增殖能力下降导致PGC数目减少,成年雌性小鼠卵泡明显减少,卵巢萎缩出现POI样表型。但是,FANCL基因突变是否与人类POI的发病相关尚不清楚。目的在中国汉族特发性POI患者中进行FANCL基因突变筛查,并对突变位点进行体外功能验证,阐明FANCL基因突变在POI发病中的作用及机制。方法募集200例中国汉族特发性POI患者和200例对照女性,对FANCL基因的14个外显子和外显子与内含子接头区域进行PCR扩增和Sanger测序,筛查突变位点。构建野生型和突变型FANCL质粒,转染野生型HEK293细胞,Western blot检测蛋白表达,免疫荧光染色检测突变蛋白细胞定位。野生型和突变型质粒转染野生型、FANCL-/-HEK293细胞,MMC处理诱导ICLs,Western blot检测细胞FANCD2泛素化水平和yH2AX表达;在HEK293细胞中敲降FANCL,MMC处理诱导ICLs,Western blot检测细胞FANCD2泛素化水平和yH2AX表达。结果一、POI患者中发现FANCL基因2个新发杂合移码突变测序发现FANCL基因11个变异位点,其中位于第13外显子c.1048₁051delGTCT（p.Q350Vfs*18）和位于第 9 外显子 c.739dupA（p.M247Nfs*4）为新发杂合移码突变,在200例对照女性中均未发现相同变异,其余的9个位点均为单核苷酸变异（single-nucleotide polymorphisms,SNP）,所有SNP位点的基因型频率和等位基因频率在POI患者和对照组中均无统计学差异。二、突变型FANCL蛋白定位异常在HEK293细胞中过表达野生型和突变型FANCL,发现p.M247Nfs*4突变导致FANCL蛋白明显截短,分子量约35kDa,而p.Q350Vfs*18突变几乎不改变蛋白的分子量。免疫荧光染色结果显示,野生型FANCL主要定位于细胞核,但p.M247Nfs*4和p.Q350Vfs*18突变蛋白滞留于细胞浆,未见细胞核定位。三、突变导致FANCL蛋白泛素连接酶活性丧失和DNA损伤修复能力受损MMC处理后,转染野生型FANCL质粒的HEK293细胞中泛素化FANCD2表达明显增加,γH2AX表达快速下降,而对照组和转染突变型质粒的细胞中泛素化FANCD2的表达量无明显差异,γH2AX恢复延迟,说明突变影响FANCL蛋白泛素连接酶活性和DNA损伤修复能力。进一步在FANCL-/-HEK293细胞中转染FANCL质粒,MMC处理后,表达突变型FANCL蛋白组中均未检测到泛素化FANCD2表达,且yH2AX表达量增加,而过表达野生型FANCL可恢复FANCL--细胞中的FANCD2泛素化,并降低γH2AX表达,说明突变型FANCL蛋白泛素连接酶功能丧失且DNA损伤修复能力下降。此外,HEK293细胞敲降FANCL后,泛素化FANCD2表达量下降,γH2AX表达水平升高,提示FANCL基因单倍剂量不足引起细胞泛素连接酶活性和DNA损伤修复能力下降。结论POI患者携带FANCL基因的两个新发杂合移码突变p.Q350Vfs*18和p.M247Nfs*4,突变引起FANCL蛋白定位异常和泛素连接酶功能丧失,进而通过单倍剂量不足导致DNA损伤修复能力受损,引起POI的发生。