研究背景:幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）是一种影响人类健康的革兰氏阴性细菌。幽门螺旋杆菌最早于1982年由澳大利亚医生巴里·马歇尔和罗宾·沃伦发现。经典理论认为其螺旋的形状（因此得名幽门螺杆菌属）已经进化到可以穿透胃粘膜并引起感染。幽门螺旋杆菌通常位于胃内。已报道其可影响胃、食管、结肠、直肠粘膜相关淋巴组织或眼周组织（又称器官结外边缘区B细胞淋巴瘤）。人类感染幽门螺旋杆菌会引起慢性活动性胃炎,但通常没有症状。长期感染幽门螺旋杆菌可引起萎缩性胃炎、上皮内瘤变和胃癌。幽门螺旋杆菌感染是胃癌发生的重要因素,但目前对其的重视程度还不够,全世界有42.8%的成年人感染了幽门螺旋杆菌。此外,34.0%的儿童也被感染。值得注意的是,一部分成人幽门螺杆菌的感染起源于儿童时期。儿童感染幽门螺旋杆菌后也可发生胃炎及其他相关性疾病。然而,儿童幽门螺旋杆菌感染相关性胃炎的发病机制尚不清楚。巨噬细胞是一种参与固有免疫调控的细胞。其被报道在幽门螺旋杆菌诱导的胃炎中发挥重要作用。然而,巨噬细胞在儿童幽门螺旋杆菌感染相关性胃炎中的作用和机制尚不清楚。幽门螺杆菌来源的空泡化细胞毒素A（Vac A）通过抑制IFN‐β信号通路破坏内吞途径,从而导致巨噬细胞凋亡。另外,为了诱导细胞凋亡,Vac A促进宿主细胞的凋亡相关基因（如caspase 8和bid）表达和线粒体依赖的凋亡级联反应。这种机制改变了宿主对幽门螺杆菌的免疫反应,从而导致慢性感染。此外,巨噬细胞对幽门螺旋杆菌的内化和吞噬作用会由于Vac A的参与而被延迟,进而影响巨噬细胞的免疫功能。但是,幽门螺旋杆菌感染后巨噬细胞的功能如何发生变化,至今不清晰。Src homology 2 domain-containing phosphatase 2（SHP2）是首次报道的具有致癌性的酪氨酸磷酸酶。它是由PTPN11基因编码的一种非受体蛋白酪氨酸磷酸酶。其在生长因子受体（如表皮生长因子受体EGFR）信号转导下游发挥重要作用。众所周知,幽门螺旋杆菌感染是引起胃炎和胃癌的主要原因之一。幽门螺旋杆菌感染胃上皮细胞后,可以通过激活SHP2抑制JAK2/STAT1信号通路。从而促进一种重要的炎症细胞因子的表达,即干扰素伽马（IFN-γ）。另外,幽门螺杆菌感染时,其特征性的细胞毒素相关基因A（Cag A）通过Cag IV型分泌系统输出到宿主细胞。Cag A可激活宿主细胞内的SHP2并引起其构象改变,进而阻断STAT1的磷酸化。此外,宿主细胞中IL-1β和TNF-α的多态性以及编码SHP2的PTPN11基因中常见的单核苷酸多聚多态性可能与Cag A阳性的幽门螺旋杆菌感染患者的胃粘膜萎缩有关。因此,激活SHP2可促进幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎。另外据报道,巨噬细胞中SHP2的缺失可缓解炎症。但激活SHP2在调控巨噬细胞中的作用,当前也并不清楚。本课题通过RNA测序分析来建立儿童幽门螺旋杆菌阳性和幽门螺旋杆菌阴性的胃炎组织的m RNA分子表达谱。我们发现:与幽门螺旋杆菌阴性胃炎组织相比,幽门螺旋杆菌阳性的胃炎组织有大量差异表达基因（DEG）。此外,幽门螺旋杆菌阳性的胃炎组织中具有异常表达的免疫反应调控相关基因,提示幽门螺旋杆菌感染后,表现出过度活跃的免疫反应。更为重要的是,我们发现在幽门螺旋杆菌感染的胃炎组织的巨噬细胞中,编码SHP2的酪氨酸蛋白磷酸酶非受体11（PTPN11）显著增加。进一步研究发现SHP2可以激活巨噬细胞的糖酵解功能,并且促进幽门螺旋杆菌诱导的炎症反应。转录因子SPI1作为SHP2的下游分子,可能负责调节代谢相关基因以及炎症因子的表达。总之,我们的研究阐明了儿童幽门螺旋杆菌感染胃炎组织的分子表达谱,提示SHP2/SPI1轴可能是幽门螺旋杆菌诱导的儿童胃炎的一个新的治疗靶点。目的:研究SHP2介导的巨噬细胞功能异常在儿童幽门螺旋杆菌感染相关性胃炎中的作用和机制。方法:收集儿童正常胃窦粘膜（8例）、儿童幽门螺旋杆菌阴性胃炎胃窦粘膜（8例）和儿童幽门螺旋杆菌阳性胃炎胃窦粘膜（8例）。采用RNA测序法检测正常胃窦粘膜、幽门螺旋杆菌阴性胃炎胃窦粘膜和幽门螺旋杆菌阳性胃炎胃窦粘膜中的差异表达基因。通过生物信息学方法分析样本的重复性,各样本基因的表达量。进一步分析差异基因的数量以及各差异基因对应的功能和分子间作用。另外,还筛选出幽门螺旋杆菌阳性胃炎胃窦粘膜相对于其他两组的Top5上调差异基因,并通过q PCR法验证Top5靶基因的表达。采用苏木素伊红（HE）染色法检测正常胃窦粘膜、幽门螺旋杆菌阴性胃炎胃窦粘膜和幽门螺旋杆菌阳性胃炎胃窦粘膜的炎症发生情况。采用Western blot法检测正常胃窦粘膜、幽门螺旋杆菌阴性胃炎胃窦粘膜和幽门螺旋杆菌阳性胃炎胃窦粘膜中SHP2的表达。通过海马代谢分析正常胃窦、幽门螺旋杆菌阴性胃炎胃窦粘膜和幽门螺旋杆菌阳性胃炎胃窦粘膜中巨噬细胞的代谢谱（包括巨噬细胞的氧化磷酸化与糖酵解情况）。采用免疫荧光检测SHP2在正常胃窦粘膜、幽门螺旋杆菌阴性胃炎胃窦粘膜和幽门螺旋杆菌阳性胃炎胃窦粘膜中的定位以及其与巨噬细胞的共定位情况。采用流式细胞术分析巨噬细胞中活性氧（ROS）,葡萄糖摄取以及乳酸生成水平。还通过在小鼠体内敲低SHP2,检测Spi1和炎症因子的表达。并进一步通过在人源巨噬细胞中敲低SPI1来验证其可调控炎症因子的表达。结果:1、与儿童正常胃窦粘膜相比,儿童幽门螺旋杆菌阴性胃炎胃窦粘膜及幽门螺旋杆菌阳性胃炎胃窦粘膜,基因表达有显著差异。2、与儿童幽门螺旋杆菌阴性胃炎胃窦粘膜相比,儿童幽门螺旋杆菌阳性胃炎胃窦粘膜表现出大量的差异基因（DEGs）,其中HP感染胃炎组中PTPN11表达较非HP感染胃炎组显著上升。3、幽门螺旋杆菌阳性胃炎组织较幽门螺旋杆菌阴性的胃炎组织具有更严重的炎症反应。4、PTPN11基因在儿童幽门螺旋杆菌感染相关性胃炎组织中高表达,并且其编码的蛋白产物SHP2表达明显高于非幽门螺旋杆菌胃炎组和正常组。5、SHP2在儿童幽门螺旋杆菌感染相关性胃炎组织的巨噬细胞中高表达。6、与正常小鼠巨噬细胞相比,脂多糖处理与幽门螺旋杆菌感染后的小鼠巨噬细胞均显示出更高的糖酵解功能。7、幽门螺旋杆菌感染的巨噬细胞糖酵解功能明显高于脂多糖处理的小鼠巨噬细胞。8、幽门螺旋杆菌感染的巨噬细胞糖酵解功能异常与过度炎症密切相关。9、敲低SHP2可抑制幽门螺旋杆菌感染的巨噬细胞糖酵解功能以及炎症反应。10、SPI1是调控差异表达基因最多的转录因子,且其调控的大部分差异表达基因与代谢以及免疫反应密切相关。11、转录因子Spi1在幽门螺旋杆菌感染的小鼠巨噬细胞中表达显著增加。12、敲低SHP2的小鼠巨噬细胞中的Spi1也相应降低。13、敲低SPI1后人源巨噬细胞中的炎症因子表达降低。结论:1、儿童幽门螺旋杆菌感染相关性胃炎组织中的巨噬细胞通过高表达SHP2促进糖酵解功能及炎症因子的高表达。2、SHP2可能通过转录因子Spi1来调控幽门螺杆菌感染的巨噬细胞糖降解功能及相应的炎症反应。