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目的:癫痫是以脑神经元过度异常放电导致反复发作性和短暂性的中枢神经系统功能失常为特征的一种脑功能失调综合征,其发病机制仍不清楚。癫痫可致脑损伤,细胞凋亡或称程序性细胞死亡启动一系列复杂的蛋白酶级联反应,是癫痫致脑损伤的一条重要途径。长时间癫痫反复发作后可出现脑内选择性的神经元凋亡坏死和海马硬化,一旦出现了海马硬化,则脑组织损伤及记忆功能障碍将不可逆。通过腹腔注射戊四氮(pentylenetrazol,PTZ)建立癫痫持续状态大鼠模型来观察大鼠海马组织的形态学改变,如采用Nissl染色法检测神经细胞丢失坏死情况;Timm染色法观察海马组织苔藓纤维出芽情况;电镜观察海马CA3区的超微结构;同时运用免疫组化法计算阳性细胞的平均光密度值;Western blot方法分别检测海马组织中caspase3和hsp70的表达情况。初步探讨了癫痫发作后caspase3介导的凋亡相关途径和Hsp70的动态表达情况,将有助于从分子水平上更有效的寻求癫痫的治疗靶点,及时进行干预并控制凋亡的发生,为减轻癫痫致脑损伤提供新方法。方法:选取清洁级(SPF级)雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠70只,实验起始体重(180±20)g, 12h光亮/黑暗条件、22℃-25℃环境温度,分笼喂养。实验动物随机分为癫痫持续状态组(status epilepticus,SE组)和对照组(normal control group,NC组)两个大组,SE组又分为癫痫发作后3h组、6h组、12h组、24h组,5组各14只。SE各组大鼠应用生理盐水溶解的1% PTZ溶液,首先按40 mg/kg腹腔注射,10 min后再给20 mg/kg,根据实验动物的发作情况再适量追加10 mg/kg,直至出现Ⅳ级或Ⅴ级发作为止。Racine将点燃分为六级评价标准,至今仍在实验中广泛应用。0级,无任何反应:Ⅰ级,湿狗样抖动,面部抽搐及咀嚼;Ⅱ级,颈部肌肉痉挛,表现为点头和/或甩尾;Ⅲ级,一侧前肢痉挛;Ⅳ级,双侧前肢痉挛伴站立;Ⅴ级,全身阵挛、失去平衡甚至跌倒。完全点燃的标准是达到Ⅳ级或Ⅴ级发作且持续30min以上。对照组注射同等容量的生理盐水。观察大鼠行为学改变,后将各组大鼠随机选取3只行Nissl染色和Timm染色法分别检测海马组织神经细胞丢失坏死情况和苔藓纤维出芽情况,3只用于电镜观察海马CA3区的超微结构,5只行免疫组化法计算阳性细胞的平均光密度值,3只用于Western blot法分别进行检测海马组织中caspase3和hsp70的表达情况。实验过程中因持续强直发作而抽搐死亡的大鼠应及时进行补充(已补充28只)。结果:1动物模型制备SE组有效应用的大鼠70只,11只应用40mg/ kg、14只50mg/ kg、15只60mg/ kg、18只70mg/ kg、8只80mg/ kg、4只90mg/ kg PTZ即开始出现惊厥,主要表现为节律性点头、肌阵挛。随着PTZ每10min注射一次,很快出现四肢抽搐,进入全面性强直发作致失去姿势控制,前、后肢强烈收缩,并伴有呼吸抑制,口周发紫,持续时间长短不等。强直阶段过后便出现全面性强直-阵挛发作。NC组动物均无行为学改变。2大鼠海马组织学改变2.1 Nissl染色观察SE组可见神经元皱缩体积缩小,胞核深染,有核分裂及核溶解,具有凋亡的特征,多数胞浆呈空泡状,海马CA1区细胞排列散乱,细胞密度小,尼氏体减少,部分神经元丢失,24h组最明显,3h脑损伤最轻;对照组海马神经元形态结构完整,胞核淡染、胞浆染色清晰,CA1区细胞几乎呈均匀一致的紫蓝色,细胞密度大,尼氏体着蓝色,形态接近正常。2.2 Timm染色法观察SE各亚组和对照组的CA3区苔藓纤维出芽评分仅0～1分。2.3海马CA3区超微结构观察SE组海马CA3区可见神经元核膜边界不清、可有内陷,染色质有边集,线粒体数量减少或有肿胀,24h组最明显,3h组较轻;对照组神经元核膜清晰,线粒体完整,细胞器基本完好。3脑组织中caspase3和hsp70表达情况SE后3h caspase3和hsp70在海马神经细胞胞浆中着色开始增多,阳性细胞率(P <0.01与对照组比较),并随时间延长其阳性细胞率相应性升高,24h明显增高(P <0.01)。对照组可见caspase3和hsp70在海马胞浆中呈现散在着色。4大鼠海马中caspase3和hsp70的蛋白表达SE后3h caspase3和hsp70表达开始增高(P <0.05与对照组比较),24h明显增高(P <0.05)。对照组仅有少量的caspase3和hsp70表达。结论:1腹腔注射戊四氮可成功诱导大鼠癫痫持续状态,是目前模拟全身强直-阵挛性癫痫发作的一种较为理想的动物模型。2癫痫发作急性期虽然引起了脑组织不同程度的形态学变化,但发作24h之内未出现明显的苔藓纤维出芽改变,表明大鼠的记忆功能无明显障碍,此期若能及时终止发作可逆转脑损伤。3癫痫发作可导致神经细胞发生凋亡,同时上调caspase3和hsp70的表达可能对脑组织在应激方面起了重要的保护角色。