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本实验所用的产NP蛋白酶的芽孢杆菌BLYS-1是本课题组2008年于宜昌土壤中分离并保存。经过初步研究发现NP蛋白酶在适宜的水解条件下能够将大豆蛋白彻底水解成小分子肽,并且水解产物无苦味,具有很好的开发潜力。为提高NP蛋白酶的表达量,设计使用强启动子cry3A与pHT304质粒构建表达载体,转化苏云金芽孢杆菌无质粒突变株BMB171得到两株重组苏云金芽孢杆菌。通过发酵产酶实验对cry3A启动子不同长度片段启动蛋白酶表达的能力进行了研究,实验结果表明pro3Ab启动蛋白酶表达的能力明显高于 pro3Aa。对这两株重组菌进行了高表达,易纯化,高产酶活性研究,并对NP蛋白酶的特性进行了初步研究。主要包括以下研究内容：
以 BLYS-1 芽孢杆菌为出发菌,通过 DPS 软件进行均匀实验设计,综合各因素对BLYS-1芽孢杆菌产酶的影响,探索出最适宜的产酶条件组合。通过稀盐酸沉淀法分离纯化了NP蛋白酶,并确定NP蛋白酶的最适水解条件为pH8.0、温度60℃和酶活持续时间4h。以豆浆为低物对NP蛋白酶的水解性能进行了研究,在50℃ 水解4h能够将豆浆中 30-100 KDa 的大分子蛋白彻底水解成 2-4 KDa 的小分子多肽。通过Native-PAGE和SDS-PAGE对NP蛋白酶的结构组成进行了研究,活性蛋白的分子量为110 KDa,共有3个35 KDa的蛋白单体组成。
以 BLYS-1 芽孢杆菌总 DNA 为模板,通过一对引物成功克隆了 np-1 基因；以T6芽孢杆菌总DNA为模板,通过两对引物成功克隆了cry3A基因的启动子pro3Aa和pro3Ab。将pro3Aa和pro3Ab与np-1基因组成融合基因并连接pHT304质粒,构建重组质粒 pBLYS-3Aa-np 和 pBLYS-3Ab-np。以重组质粒 pBLYS-3Aa-np 和pBLYS-3Ab-np 电击转化 BMB171 ,成功筛选出两个转化子 BLYS-3Aa-np 和BLYS-3Ab-np,对这两个转化子进行产酶实验,证明两株重组菌可成功表达蛋白酶。
对重组菌BLYS-3Aa-np和BLYS-3Ab-np进行发酵产酶试验,通过Native-PAGE结合干酪素平板对产酶条件进行了探索。Native-PAGE测定重组菌发酵液中蛋白酶分子量为110 KDa,SDS-PAGE测定重组菌蛋白酶亚基为35 KDa,与BLYS-1发酵液测定结果一致,说明重组菌成功表达了NP蛋白酶。重组菌BLYS-3Ab-np表达110 KDa蛋白酶的活性高于BLYS-3Aa-np和BLYS-1,说明pro3Ab启动子具有强的启动转录的能力,构建的高表达菌株成功。
对发酵液用 Folin-酚法测酶活,测得的结果为 BLYS-3Aa-np ( 65U )
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