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目的原花青素可以通过上调Nrf-2通路明显的抑制氧化应激对多种组织器官造成的损伤,但该作用在肌腱组织中鲜见报道。本文旨在研究原花青素对肌腱抗氧化应激的作用,初步明确原花青素的抗氧化作用机制,为肌腱损伤的发病机制及治疗提供实验数据和理论基础。方法一、细胞实验1、从SD大鼠肌腱组织中提取肌腱干细胞(tendon-derived stem cells,TDSCs),并进行传代培养至第3代,用于后续实验。2、通过流式细胞术对提取的TDSCs进行细胞种类鉴定。3、以不同浓度的原花青素(Proanthocyanidins,PCs)单独作用于TDSCs,排除PCs对TDSCs的毒副作用。4、以不同浓度的H2O2作用于TDSCs,摸索构建氧化应激模型的最佳浓度——半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。5、将半抑制浓度的H202作用于经不同浓度的PCs预处理的TDSCs,并通过CCK-8法来测定TDSCs的细胞活性。6、应用Real Time-PCR法及Western Blot法检测PCs对TDSCs中Nrf-2基因及其下游GCLM、HO-1、NQO-1基因表达的影响。二、动物实验1、取15只成年雄性SD大鼠,分为空白组、对照组(过度使用模型组)、实验组(PCs预处理+过度使用组)三组,每组5只。2、对空白组、对照组中的大鼠仅以灭菌水灌胃,而实验组则以100mg/kg PCs灌胃。3、将SD大鼠放置于大鼠跑台上,以17m/min的速度进行10°的上坡跑,每天进行1h,每周进行5天,以建立肌腱过度使用的模型。在进行正式模型建立之前,进行5天适应训练。4、建立模型2周后取大鼠眼球血血清,进行氧化应激指标SOD、MDA、抗-OH及抗O2·-的测定。5、取SD大鼠肌腱组织,行病理切片HE染色。结果1、分离的TDSCs在P3呈纺锤状、多角状等形态生长,并结合流式细胞术对其表面标记物测定结果显示,有96.8%的细胞对间充质干细胞标记CD90(阳性标记物)高表达,仅有0.65%对内皮细胞标记CD31表达(阴性标记物),并根据相关文献结果证实分离细胞为TDSCs。2、在CCK-8试验中,不同浓度的PCs单独作用于TDSCs,细胞活性无明显差异,证实PCs对TDSCs无明显毒副作用。且在H202的处理下,经PCs预处理的TDSCs细胞活性明显高于H202组,且各浓度PCs组之间的细胞活性无明显差异,证实PCs在低浓度状态下即可发挥出强大的抗氧化作用。3、在RT-PCR检测中,与对照组相比,H202和PCs的单独作用都可上调TDSCs中Nrf-2及其下游基因GCLM、NQO-1、HO-1的表达,且PCs的作用更明显,而PCs+ H202组的各个基因表达均达到最高水平。4、在WB检测中,虽然在各种组中Nrf-2的蛋白表达无明显统计学差异,但在各组间的表达中呈上升的趋势。而GCLM及HO-1的表达在H202、PCs、PCs+H2O2三组中的表达依次增高,与RT-PCR结果一致。5、在动物实验中,过度使用组MDA水平明显增高,表明大鼠肌腱过度使用模型造模成功,且SOD活性、抗·OH及抗O2·-能力在过度使用组中均有相应增强。而PCs组中MDA水平较过度使用组明显降低,显示出PCs的抗氧化作用,同时SOD活性、抗·OH及抗O2·-能力也得到了较大的增强。6、在大鼠肌腱的病理切片中,低倍镜(100×)下可见在正常肌腱组织内,肌腱纤维蛋白组织互相平行,且相互排列紧密有序。在高倍镜(400×)下可见细胞核深染且呈纺锤型或梭型,位于肌腱纤维蛋白组织中央。而在过度使用组中,可见到肌腱纤维蛋白组织明显的紊乱甚至断裂,而细胞核变圆且着色加深。经PCs处理的大鼠肌腱组织,在病理切片中可见比较明显的结构紊乱,排列稀疏,但未见明显的肌腱纤维断裂。虽然实验组的细胞核也有向圆形发展的趋势,但仍可见少量梭型或纺锤形的细胞核。可见经PCs处理后肌腱组织在形态学上较过度使用组有明显的改观。结论1、PCs单独作用于TDSCs时无明显的细胞毒性作用,且能通过上调TDSCs中Nrf-2的表达,从而进一步上调其下游基因GCLM、NQO-1、HO-1的表达,以达到明显改善H202引起的氧化应激损伤的作用。2、在大鼠体内,PCs可以通过增强SOD活性,以及抗· OH及抗O2·-能力,从而缓解过度使用引起的氧化应激损伤。