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第一部分两种方法诱导小鼠胚胎干细胞分化为内皮细胞目的：探讨小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)向内皮细胞(endothelial cell, EC)诱导分化的能力,使用两种方法(三维培养体系和二维体系体系)将ESCs分化为高纯度的胚胎干细胞来源内皮细胞(murine embryonic stem cell-derived endothelial cells, ESDECs),比较三维法和二维法ESCs诱导体外定向分化为ECs的优缺点和效率。材料和方法：利用小鼠ESC经悬滴法形成拟胚体(embryoid bodies, EBs)(三维法),EBs于第3d转悬浮培养,第5d贴壁培养,开始在EGM-2培养液和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)作用下定向诱导分化为内皮细胞(endothelial cells, ECs),第9d,以胎肝激酶-1(fetal liver kinase, Flk-1)作为标志物进行流式分选,分选出Flk-1+的ESDEC。二维法中,ESCs先转至Ⅳ型胶原体系中,用去除白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)的培养液培养,第4d,以Flk-1进行流式分选,分选后Flk-1+细胞在纤连蛋白(fibronectin, FN)包被培养皿上继续培养,EGM-2培养液中额外加入VEGF (50ng/ml).约1w后,人工分选出鹅卵石形态的内皮样细胞并加以纯化。所得ESDEC行逆转录聚合酶链反应、免疫荧光及流式细胞标志物鉴定,评估PECAM-1、VE-Cadherin、Tie-2、Flt-1、Flk-1、vWF及Oct-4的mRNA表达水平,各分化阶段PECAM-1、CD34和VE-cadherin的动力学、吞噬DiI-ac-LDL和体外成管能力等细胞学行为。结果：1ESCs在丝裂霉素处理过的小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts, MEF)饲养层上和LIF作用下,可以保持未分化状态,未分化的ESC表现为圆形或椭圆形、平坦、细胞排列紧密的细胞团。2.利用悬滴法培养出的EB大小均形成率高(>90%),在三维培养体系中EB有出芽等血管新生现象,所形成的管状结构免疫荧光染色CD31阳性,提示主要为ESDECs构成。3.二维体系中,Flk-1+细胞呈现两种细胞形态,即鹅卵石样的内皮细胞样细胞和条索状的平滑肌样细胞。经过人工分化和纯化,逐渐成为高纯度的ESDECs,形态单一同内皮细胞,并可以长期传代。4.两种方法分化的ESDECs细胞学行为与对照组小鼠主动脉内皮细胞(murine aortic endothelial cells,MAECs)相似,可表达与EC相似的内皮细胞特异性因子,有内皮细胞特异性基因表达,Dil-ac-LDL吞噬实验阳性,可在matrigel上生出管状结构。5.二维法中流式分选的Flk-1+细胞比例(23%)要高于三维法(13%),经纯化后,ESDECs表达VE-Cadherin的细胞比例也要高于后者(分别为98%和95%),二维分化体系简单有效。结论：两种方法均可成功诱导ESCs定向分化为ESDECs,是有效的ESC定向分化为成熟EC的体外细胞模型,分化出的ESDECs细胞生物学行为与MAECs相同,但二维法的效率要高于三维法。第二部分CLIO-Tat标记小鼠胚胎干细胞的体外MR成像及对其定向内皮细胞分化的影响目的：确定HIV-Tat蛋白转导域交联氧化铁复合物(HIV transduction domain cross-linked iron oxide, CLIO-Tat)标记ESCs的最佳标记条件,评估CLIO-Tat标记对ESCs及其定向分化后EC细胞活力、增殖、细胞标志物等细胞学行为有无影响。材料和方法：本实验分两部分：1.分别选用不同浓度CLIO-Tat和标记时间与小鼠ESCs共孵育,然后运用普鲁士蓝染色、细胞内铁浓度、体外细胞凝胶磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)评估标记效率；用台盼兰拒染实验、MTT实验评估细胞活力、毒性和增殖能力,确定CLIO-Tat标记ESCs的最佳标记条件。2.利用CLIO-Tat、CLIO或Tat标记ESCs,评估上述不同标记物标记后ESCs的细胞活力、细胞毒性和增殖能力以及细胞周期和凋亡,并测定各标记组ESCs定向分化(二维法)的ESDECs的细胞表面标志、EC特征性基因表达成管能力、增殖能力等,了解CLIO-Tat、CLIO以及Tat对ESC定向分化的影响。结果：1.使用CLIO-Tat (50μg/ml)标记ESCs 24h后,普鲁士蓝染色可见胞质内有蓝色颗粒,细胞内铁浓度为(25.3±2.1) pg, CLIO-Tat标记对细胞活力、增殖、细胞周期和凋亡等均无影响,体外凝胶MR成像T2*WI为低信号。2.CLIO-Tat (50μg/ml)标记分选后的ESCs经二维体系体外诱导分化为ESDECs,后者的细胞学行为与血管内皮相似,可表达与对照组(MAECs)相似的内皮细胞特异性因子,有内皮细胞特异性基因表达,DiI-ac-LDL吞噬实验阳性,可在三维培养体系(matrigel)中生成管状结构,CLIO及Tat标记ESCs也未抑制ESDEC的体外成管能力。结论：1.CLIO-Tat标记ESCs的最佳标记条件是CLIO-Tat 50μg/ml,体外共孵育24h；体外细胞凝胶MR成像可对CLIO-Tat标记ESCs进行有效示踪,T2*WI是最有效的成像序列。2.CLIO-Tat、CLIO及Tat标记ESCs不会影响ESCs的生物学行为及其向EC定向分化能力,分化后的ESDECs生物学行为和对照组(MAECs)相一致。第三部分CLIO-Tat标记小鼠胚胎干细胞分化的内皮细胞及其移植后的体内MRI示踪研究目的：评价CLIO-Tat标记mESDECs移植后MR成像活体示踪的可行性和有效性,并对CLIO-Tat标记ESDECs移植治疗小鼠后肢缺血模型的效果进行评价。材料和方法：建立小鼠后肢缺血动物模型,将ESDECs和ESCs分别与CLIO-Tat-FITC或CLIO共孵育24h,分别注射入动物模型缺血肢体肌肉内(分组情况为A:CLIO-Tat-FITC标记ESDECs移植组、B:CLIO-Tat-FITC标记ESCs移植组、C:CLIO标记ESDECs移植组、D:PBS注射组)。植入后即时及每周(1～4w),分别行MRI。各组动物模型制作前及细胞移植术后每周(1～4w)激光多普勒血流检测后肢血供,并进行缺血后肢功能评分。第4w后取小鼠后肢标本,行HE染色和普鲁士兰铁染色,Ⅷ因子相关抗原和Mac-3免疫组化染色,并计算缺血组织的微血管血管密度(Microvessel counting,MVC)。结果：使用CLIO-Tat-FITC (50μg/ml)标记ESDECs后,普鲁士蓝染色和免疫荧光可见细胞胞质内磁性标记颗粒。移植后,MRI可显示缺血部位植入的ESDECs和ESCs分布和迁移情况,T2*WI为低信号,直到术后4周。激光多普勒、肢体功能评分及MVC显示：磁标记细胞(CLIO-Tat-FITC标记ESDECs、CLIO-Tat-FITC标记ESCs和CLIO标记ESDECs移植组)植入后肢体血供较对照组都有改善。组织学和免疫组织化学显示ESCs植入后有畸胎瘤形成可能,ESDECs组则未见。结论：CLIO-Tat标记ESDECs安全有效,标记后可运用MRI对细胞进行活体示踪。同时,CLIO-Tat标记ESDECs移植后能够促进缺血组织的血管新生,改善血供。此外,未分化的ESCs植入后可形成畸胎瘤,分化后的ESDECs则相对安全。