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磷壁酸是革兰氏阳性细菌细胞壁的重要组成成分。据报道,其在细菌的生长与繁殖、抵抗生素以及对宿主细胞的粘附与定植方面有着非常重要的作用。而磷壁酸酶是一类可以特异性地降解磷壁酸的磷酸二酯酶。因此,研究磷壁酸酶将从革兰氏阳性细菌的另一个方向对治疗因细菌感染而引起的疾病给出一定的指导作用。此外,根据Wise、Kusse、Myers等人的报道,推测在黑曲霉以及芽孢杆菌科中存在着可以特异性降解磷壁酸的新型磷壁酸酶。因此,利用生物信息学知识,基于功能域和已报道的壁磷壁酸降解酶GP12序列同源性在NCBI、KEGG等数据库中进行检索,发现了来自于Aspergillus niger的基因An18g03170与来自于Bacillus clausii的基因PRAP（phage-related pre-neck appendage protein）。本实验将基因An18g03170、PRAP、GP12分别克隆至pET-21a（+）载体,转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达,纯化后对3种蛋白进行了性质鉴定与分析,结果如下:（1）磷壁酸提取菌株的选择及制备:以金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌114为出发菌株,用三氯乙酸法提取磷壁酸,然后用DEAE Fast Flow树脂进行纯化,收集液消解后使用磷钼蓝比色法测得总磷含量,继而换算得到磷壁酸的提取得率。金黄色葡萄球菌的提取得率为6.13%,枯草芽孢杆菌114为4.23%,对比发现,金黄色葡萄球菌的提取得率高于枯草芽孢杆菌114,且都无核酸和蛋白质的残留。因此,选择金黄色葡萄球菌进行磷壁酸的制备。（2）基因An18g03170、PRAP、GP12的克隆及表达:提取黑曲霉野生型的总RNA,利用RT-PCR获得基因An18g03170,其序列经测序比对与NCBI上公布的序列有6个氨基酸不一致,这可能与使用菌株不同有关;基因GP12、PRAP设计好后均由苏州金唯智生物科技有限公司合成,序列均与NCBI上公布的序列完全一致。将3个基因分别构建到pET-21a（+）载体上,转入大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。An18g03170蛋白表达正确,经过诱导条件优化后可溶性蛋白量有明显提高;PRAP蛋白在经过诱导条件优化后,90%以上形成了可溶性蛋白;GP12蛋白虽然经过诱导条件的优化,但是仍然很难形成可溶性蛋白。（3）基因GP12的优化:GP12蛋白包涵体的大量形成,经过对Myers报道的GP12蛋白的分析,将GP12构建至pET-28a（+）。经过16℃,170rpm,1mM的IPTG诱导表达,发现GP12蛋白在上清中出现了大量的可溶性蛋白。（4）候选蛋白的纯化:An18g03170蛋白虽然有不错的可溶性蛋白表达量,但用Ni-NTA Agrose纯化时无法亲和,推测组氨酸标签被隐藏在结构中;PRAP蛋白经过纯化得到了条带单一的蛋白,但是其迁移速率慢,其位置偏大大约18 KDa,这可能与其含有较多的酸性氨基酸有关,无法结合足够的SDS所导致。GP12蛋白通过纯化也得到了单一条带的蛋白。（5）酶活性的鉴定:候选蛋白分别以bis-pNPP和磷壁酸为底物检测活性,发现纯酶PRAP和GP12对底物bis-pNPP催化的最适温度为37℃,最适pH为4.8,二者的热稳定基本相同,但PRAP的Kcat/Km高于GP12;PRAP和GP12催化磷壁酸降解的最适温度均为37℃,但PRAP催化的最适pH为6.0,GP12的最适pH为6.6。PRAP和GP12在各自的最适温度和pH下测定Km值,结果表明二者性质差异不大。An18g03170蛋白粗酶液对bis-pNPP的降解能力,相对于含有空载pET-21a（+）的菌株破碎上清有显著活性,但是并没有纯化到该酶。（7）金属离子对纯酶PRAP和GP12催化活性的影响:以终浓度为5 mM的金属离子添加到反应体系中,测定结果表明Mg2+、Ca2+对PRAP和GP12的催化活性具有激活作用,Fe2+、Mn2+则具有抑制作用,Cu2+对GP12具有抑制作用,对PRAP具有激活作用。（6）候选蛋白对金黄色葡萄球生长的影响:以金黄色葡萄球菌作为指示菌,发现An18g03170蛋白粗酶液、蛋白PRAP、GP12均对金黄色葡萄球菌的生长无明显的抑制作用,对其生长速率也无显著影响。