羊肚菌菌核培养特征及遗传特性研究

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羊肚菌生理及遗传特性复杂多变,在培养过程中不同分离物菌丝和菌核的形态学变化较大且极不稳定,产菌核特性与子实体形成的联系也仍有争议。本文以云南大田栽培尖顶羊肚菌和粗柄羊肚菌分离的单孢群体为材料,以产菌核为形态标记,进行了固体液体培养微观宏观观察,单孢菌株基质利用稳定性研究,扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)研究和产菌核相关基因mRNA差异显示技术分析。论文主要的研究结果和结论如下:(1)在酵母膏蛋白胨葡萄糖琼脂(YPD)培养基上培养的尖顶羊肚菌和粗柄羊肚菌分离的单孢群体按培养特征可分为9类,同等条件下每一菌株的培养特性保持稳定;并以是否产菌核为标准把单孢菌株分为产菌核单孢菌株群体和不产菌核单孢菌株群体。(2)不同培养基转接培养时,可观察尖顶羊肚菌和粗柄羊肚菌的菌丝形态变化和产菌核的稳定性,结果为尖顶羊肚菌单孢菌株的菌丝形态及产菌核稳定性强于其多孢及粗柄羊肚菌单孢菌株。(3)尖顶羊肚菌同一子实体及不同子实体的产菌核单孢菌株与不产菌核单孢菌株对峙培养后两者性状会发生较大变化,包括菌核形态、菌丝形态、生长势,特别是产菌核能力会消失和相互转移。(4)对尖顶羊肚菌和粗柄羊肚菌分离的两类单孢菌株进行液体静置和振荡培养,比较了两者宏微观形态特征,发现在静置培养下产菌核单孢菌株仍会产菌核,而振荡培养时均不产菌核;两类单孢群体在培养时菌丝的宏观形态特征(菌丝厚度,密度和色泽)有较大差别,而微观形态特征差异较小(5)本实验对菌核形成的整个过程进行了显微跟踪观察,建立了完整的菌核形成过程的微观特征图片库。(6)以是否产菌核及产菌斑为标准将49个尖顶羊肚菌子实体ZD-18单孢分离菌株分为四组,并以1个组织分离菌株为对照,采用AFLP技术进行DNA多态性分析。用筛选出的4对引物进行扩增,在100bp-600bp有效带范围内的495条带都具有多态性,通过Nei’s无偏遗传相似度及遗传距离(1978)的UPGMA聚类分析,在遗传间可将50个菌株分为11个组群,且与四个形态分组的多态性指数很一致,但形态和遗传仅在产菌斑性状上具有对应趋势,产菌核性状的遗传聚类说明其基因表达复杂多变,可利用研究得出的多态性遗传图谱进行较深入的分子研究。(7)以尖顶羊肚菌子实体ZD-23和ZD-18分别分离得到的两株产菌核和两株不产菌核菌株为材料进行了72对引物组合的mRNA差异显示(DDRT-PCR)分析,并对所得差异片段进行克隆测序,利用测序结果合成特异引物进行半定量验证。得到13条与羊肚菌产菌核相关的阳性差异片段,分别与Y-氨基丁酸通透酶、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶、外膜家族蛋白相关蛋白、人类角蛋白结合蛋白、核糖体RNA反义转录蛋白、裂殖酵母细胞周期依赖激酶C-3、块菌rho胍解离抑制剂、钙钠交换蛋白及脂结合蛋白相关基因具有一定的相似性。此外,一些阳性片段在NCBI数据库里为假设蛋白或无法找到的相似性基因片段,作为与羊肚菌产菌核相关的特有的功能基因,它们为深入研究羊肚菌产菌核的分子机理提供了重要的材料。总之,羊肚菌产菌核特性在形态和分子遗传上较多变,且易受环境因素的影响,其性状的发生与许多基因表达有关,有待对其中的一些特异序列进行更深入的研究。
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