耐辐射奇球菌RecJ和DdrB的功能研究

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耐辐射球菌最为突出的是其对电离辐射有超强的抗性,而电离辐射主要导致细胞内DNA双链断裂,其超强DNA修复能力使其成为研究DNA双链断裂修复机制的一种理想模式生物。其细胞内重组修复ESDSA途径的起始过程尚未完全解析,其中的核酸酶RecJ还需要进一步研究;同时有人针对耐辐射球菌中的特殊蛋白DdrB提出了双链断裂修复的单链退火途径,作为ESDSA途径的起始过程的补充,这种DdrB依赖的链退火也需要更多的数据支持。   为了研究耐辐射奇球菌中RecJ的功能,我们构建了recJ突变菌株。我们发现rec基因的缺失导致生长速度变慢,而且呈现出高温敏感特性。然而,recJ突变菌株的耐辐射能力只是出现了一定程度的下降,下降幅度远小于RecF、RecA突变株。我们的结果显示rec在耐辐射奇球菌中是非必需的,在一定程度上参与了耐辐射球菌辐射后的DNA损伤。   我们表达并纯化了RecJ蛋白,来研究它的生化活性。耐辐射球菌RecJ表现出锰离子依赖的核酸酶活性,最适锰离子浓度是0.1mM。当在不同浓度锰离子存在的反应中加入10mM镁离子的时候,RecJ表现出稍高并相似的核酸酶活性,这说明锰离子可能是RecJ的一个调节因子。当单链DNA5末端长度小于6nt核苷酸时,大肠杆菌RecJ不再有活性;而耐辐射奇球菌RecJ蛋白可以非常有效地切除4nt长的5单链DNA末端,这说明耐辐射奇球菌RecJ蛋白的底物范围更加广泛。另外,耐辐射奇球菌单链结合蛋白SSB促进了RecJ的核酸酶活性,而DdrB抑制了RecJ的核酸酶活性,起到了保护单链DNA的作用。总体来说,耐辐射奇球菌RecJ蛋白的活性受到了锰离子浓度和SSB、DdrB调控。   鉴于DdrB与SSB的不同,我们进一步探讨了耐辐射球菌中存在的特殊蛋白DdrB的DNA结合特性。我们发现DdrB结合单链DNA的能力要弱于SSB,DdrB可以同样解开单链DNA上的复杂结构,说明了DdrB也具有较强的单链DNA结合能力;同时我们发现DdrB可以优先结合58 nt左右长度的单链DNA。而SSB和DdrB两个蛋白在单链DNA上的关系也进行了深入探讨,在短链DNA上,DdrB不能取代SSB结合到单链DNA上,而SSB可以将DdrB替代下来,主要以SSB-DNA的形式存在;在58nt左右及更长的单链DNA上,SSB和DdrB竞争结合单链DNA,SSB可以将DdrB从单链DNA上替代下来,同样DdrB也可以取代SSB结合到单链DNA上。SSB和DdrB两个蛋白对单链DNA的竞争结合调节和分配了传统的ESDSA修复路径和单链退火路径的起始过程。
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