背景及目的唾液腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma,SACC）约占唾液腺恶性肿瘤10%,常见复发、远处转移以及对常规治疗方法的抵抗。目前SACC标准治疗方案是手术切除,必要时辅以放射治疗,但临床治疗效果不佳,尤其是已复发/转移的进展性SACC病例预后较差,远期（10-15年）生存率仅为10%-20%。因此,探讨SACC的发生发展机制,找寻新型治疗靶点,对提高现有治疗效果及远期预后具有重要意义。近年来,基因组不稳定（genomic instability,GIN）被认为是导致肿瘤进展的关键因素,主要由DNA损伤及修复异常引起,包括染色体不稳定（chromosomal instability,CIN）和微卫星标记不稳定（microsatellite instability,MSI）两种类型。在所有DNA损伤类型中,DNA双链断裂（double-strain break,DSB）是最严重的损伤形式,如果累积过多或被错误修复,会导致细胞死亡或携带染色体不稳定继续增殖,促使肿瘤发生及恶性进展。DNA双链断裂修复通路包括精确修复通路经典非同源末端连接（classical non-homologous end joining,c-NHEJ）和同源重组（homologous recombination,HR）,以及易错修复通路替代性非同源末端连接（alternative non-homologous end joining,alt-NHEJ）。在正常细胞中,细胞修复DNA双链断裂的通路以c-NHEJ及HR为主,alt-NHEJ作为“替补”,修复活性仅维持在相对较低的水平,因为在alt-NHEJ中,微同源片段介导DNA单链碱基配对连接DNA双链断裂的两端,导致DNA连接产物存在小部分缺失或插入,进而产生染色体易位和诱变重排等基因组不稳定。此外,错配修复通路（mismatch repair,MMR）功能缺陷通常是导致微卫星标记不稳定的最主要原因。本课题组在前期研究中发现,PTEN低表达的SACC病例中alt-NHEJ通路关键蛋白POLQ异常高表达并与恶性程度高、预后差有关,初步认为POLQ可能通过调控基因组稳定性促进SACC进展。依托泊苷（etoposide,ETP）作为一种传统的抗癌药物,其机制是通过抑制拓扑异构酶II的活性,防止DNA复制过程中临时形成的DNA双链断裂重新连接,促进DNA双链断裂的形成。目前已被广泛用于治疗多种癌症,例如肺癌、睾丸癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌、宫颈癌。奥拉帕尼（olaparib,OLA）是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+）类似物,主要通过与NAD+竞争催化alt-NHEJ通路另一关键蛋白PARP1（poly（ADP-ribose）polymerase 1）的活性位点,抑制PARP1活性,目前已广泛用于多种临床多种肿瘤的治疗。此外,目前SACC细胞中POLQ表达的直接调控机制未见报道,因此,阐明SACC中POLQ调控基因组稳定性的分子机制,并找到POLQ上游的直接调控因子,是提高现有治疗效果及远期预后的关键。综上,本文旨在利用两种SACC细胞系SACC-83及SACC-LM,通过探讨POLQ对SACC基因组稳定性的影响及分子机制,观察在DNA损伤环境中靶向抑制POLQ或POLQ相关通路是否通过促进SACC细胞DNA损伤有效抑制细胞增殖、迁移、侵袭并诱导凋亡,以及明确SACC中POLQ表达的直接调控机制,为阐明SACC细胞维持基因组稳定性的分子机制提供新方向及新思路。本研究内容分为三个部分。第一部分,从染色体稳定性及微卫星标记稳定性两方面分析POLQ对SACC基因组稳定性的影响;第二部分,进一步通过观察POLQ对三条DNA双链断裂修复通路及MMR通路关键蛋白表达水平的影响,探讨POLQ调控SACC基因组稳定性的分子机制,并通过体内和体外两方面观察在依托泊苷诱导的DNA损伤环境中,靶向抑制POLQ对SACC细胞基因组稳定性、增殖、迁移、侵袭及相关通路的影响;第三部分,从体内和体外两方面观察奥拉帕尼联合依托泊苷对SACC染色体稳定性、细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响,并找寻预测直接调控POLQ表达的上游转录因子。方法1、通过基因表达谱数据动态分析（gene expression profiling interactive analysis,GEPIA）分析并比较POLQ在人腺上皮来源肿瘤组织及同位正常组织中的表达水平;2、采用瞬时转染的方法构建靶基因表达降低或过表达的SACC-83或SACC-LM细胞模型;3、通过荧光实时定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）及免疫印迹（western blot,WB）实验检测基因m RNA及蛋白表达水平;4、应用DAPI荧光染色观察细胞核形态;5、姬姆萨染色观察细胞染色体的变化;6、CCK-8细胞增殖实验检测细胞增殖能力,Transwell小室实验及基质胶侵袭实验检测细胞迁移及侵袭能力;7、通过聚合酶链式反应-单链构象多态性分析（quantitative real-time polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP）检测细胞微卫星标记位点稳定性;8、将SACC细胞悬液接种于裸鼠皮下,构建SACC裸鼠皮下移植瘤模型,待肿瘤长至约50mm~3时,将裸鼠分组进行实验。瘤内注射POLQ-sh RNA或POLQ过表达质粒,或腹腔注射依托泊苷及奥拉帕尼。给药注射开始于接种后第15天,14天后收集并测量肿瘤体积及质量;9、通过CCK-8药物敏感性实验检测SACC-83细胞对依托泊苷及奥拉帕尼的敏感性,并计算药物半抑制浓度(IC50);10、免疫荧光染色（immunofluorescence,IF）方法检测γH2AX在细胞中的表达水平;11、用生物信息学预测网站PROMO、Cistrome Data Browser、JASPAR和GEPIA网络数据库预测潜在调控POLQ基因表达的转录因子及结合位点;12、双荧光素酶报告基因实验验证预测转录因子与POLQ启动子的特异性结合;13、通过免疫组织化学染色（immunohistochemistry,IHC）,检测裸鼠皮下移植瘤组织中DNA双链断裂标志物γH2AX、细胞凋亡关键蛋白CASPASE-3以及细胞增殖标志物KI-67的表达及分布情况;14、采用独立样本t检验比较样本间差异,p*＜0.05被认为组间具有统计学差异,p**＜0.01及p***＜0.001被认为组间具有高度统计学差异。结果1、POLQ在SACC基因组稳定性中的作用研究腺上皮来源肿瘤POLQ表达水平高于同位正常组织;恶性程度较高的SACC-LM细胞中POLQ表达水平高于恶性程度相对较低的SACC-83细胞。在此基础上我们成功构建了POLQ过表达及敲低的SACC细胞模型。发现POLQ表达降低和升高均能增加异形核的比例,POLQ表达降低或升高均增加异常染色体的比例,POLQ正调控有丝分裂及端粒酶关键基因CENP-A、HJURP及TERT的表达;POLQ对SACC-83细胞微卫星标记稳定性无明显影响。此外,体外研究结果显示,POLQ表达降低和升高均能抑制SACC细胞增殖、迁移及侵袭能力;体内研究结果显示,POLQ高表达抑制SACC裸鼠皮下移植瘤的生长并促进SACC裸鼠皮下移植瘤中γH2AX的表达。2、阻断POLQ所在信号通路对SACC细胞DNA损伤敏感性的影响及POLQ表达调控机制研究POLQ表达升高或降低均能促进SACC细胞γH2AX的表达,且无论是否在依托泊苷诱导的DNA损伤环境中,POLQ负调控c-NHEJ通路关键蛋白KU70与HR通路关键蛋白RAD51的表达,正调控alt-NHEJ通路关键蛋白PARP1的表达;POLQ对微卫星标记稳定性相关MMR通路关键基因MLH1的表达水平无明显影响。此外,依托泊苷随着剂量的增加以剂量依赖的方式抑制SACC-83细胞的活力,IC50约为3μM;DNA损伤剂依托泊苷随着剂量的增加以剂量依赖的方式促进SACC-83细胞γH2AX的表达;POLQ表达升高或降低均能协同依托泊苷促进SACC细胞表达γH2AX;POLQ表达升高或降低均能协同依托泊苷促进SACC细胞异形核比例的增加;POLQ表达升高或降低均协同依托泊苷促进SACC细胞染色体断裂比例的增加。体外研究结果显示,POLQ表达升高或降低均能协同依托泊苷抑制SACC细胞增殖、迁移及侵袭能力;体内研究结果显示,POLQ表达降低协同依托泊苷抑制SACC裸鼠皮下移植瘤的生长并促进SACC裸鼠皮下移植瘤中γH2AX的表达。3、阻断POLQ所在信号通路促进SACC对DNA损伤的敏感性及POLQ表达调控机制研究奥拉帕尼随着剂量的增加以剂量依赖的方式抑制SACC-83细胞的活力,IC50约为58μM。体外研究结果显示,在DNA损伤环境中,奥拉帕尼抑制SACC-83及SACC-LM增殖、迁移及侵袭能力;体内研究结果显示,在DNA损伤环境中,奥拉帕尼抑制SACC裸鼠皮下移植瘤的生长,促进SACC裸鼠皮下移植瘤中γH2AX的表达,增加细胞凋亡关键蛋CASPASE-3阳性细胞率、降低细胞增殖标志物KI-67阳性细胞率。此外,我们预测出调控POLQ表达的上游转录因子CEBPB、FOXM1、YY1与ESR1,q RT-PCR实验结果显示PTEN下调的SACC-83细胞中转录因子CEBPB与FOXM1高表达,YY1与ESR1低表达;双荧光素酶基因报告实验结果显示,转录因子CEBPB及FOXM1分别特异性结合POLQ启动子区域;CEBPB正调控SACC细胞中POLQ表达。结论POLQ在恶性程度高的SACC中高表达;POLQ表达升高或降低均导致SACC染色体不稳定,对微卫星标记稳定性无影响;POLQ表达改变显著抑制SACC细胞增殖、迁移、侵袭及异种移植瘤的生长。POLQ通过调控SACC细胞DNA双链断裂修复影响染色体稳定性;POLQ激活alt-NHEJ通路,抑制HR及c-NHEJ通路;靶向抑制POLQ协同依托泊苷通过促进SACC细胞DNA损伤,抑制SACC细胞增殖、迁移、侵袭及异种移植瘤的生长。应用奥拉帕尼特异性抑制POLQ所在通路在体外提高SACC细胞对DNA损伤的敏感性,在体内协同依托泊苷抑制SACC染色体稳定性及裸鼠皮下移植瘤生长,作用机制是二者协同诱导DNA双链断裂、抑制细胞增殖能力并促进细胞凋亡;此外,转录因子CEBPB可能是介导PTEN负调控POLQ的中间因子,通过直接促进POLQ表达,调控SACC染色体稳定性。