利用酵母双杂交系统筛选铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiA的相互作用蛋白

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蓝藻是目前已知具有生物钟节律的最简单生物,它的生物钟基因簇kai由三个基因组成,分别是kaiA,kaiB,kaiC,它们已被证明是维持蓝藻基本生物钟节律所必需的,其中任何一个基因的缺失都会导致生物钟节律的消失。在生物钟节律产生的过程中,Kai蛋白相互之间以及它们与其他蛋白之间的相互作用可能起着关键作用。其中KaiA的作用是作为一种传递来自输入途径信息的通道,它通过接受环境信息后整合入钟蛋白复合体中,进而激活KaiC自身磷酸化使之发生构象变化。这种Kai蛋白之间和Kai蛋白与其它蛋白的相互作用以及KaiC蛋白的磷酸化状态,构成了由Kai蛋白振荡器产生生物钟守时机制的核心。 酵母双杂交系统是研究蛋白相互作用的常用方法,为了研究铜绿微囊藻生物钟基因(Microcystisaeruginosa)kaiA的功能找到与其相互作用的蛋白,我们通过PCR方法克隆得到该基因,然后将其克隆入酵母双杂交流系统所用的钓饵载体pGBKT7和猎物载体pGADT7中,经测序证明正确后,分别将两组质粒pGBKT7-kaiA/pGADT7-kaiA和pGBKT7-kaiA/pGADT7转化入酵母菌AH109中,分析其表达产物是否会影响酵母菌的生长以及能否激活报告基因转录。实验结果表明KaiA蛋白对酵母菌AH109无毒性,也不能激活报告基因转录,同时也证实了KaiA蛋白在转化酵母菌中可以发生自身相互作用。实验还表明我们可以将pGBKT7-kaiA作为酵母GAL4双杂交系统的钓饵载体,从铜绿微囊藻基因组文库中钓取与KaiA相互作用的蛋白。因此,我们构建了两种铜绿微囊藻基因组文库:pGADT7-Sau3AI和pGADT7-HapⅡ,然后通过酵母双杂交系统筛选基因组文库中可能与KaiA相互作用的蛋白。实验最终共筛选得到23个阳性克隆,通过测序和比对,发现其中有7个未知蛋白与蓝藻有关,为了确定这些蛋白与KaiA相互作用的结构域,我们分别深入分析了这些蛋白所包含的各种功能结构域与KaiA之间的相互作用。结果表明,下列功能结构域:DUF29,TRCF,PAP-fibrillin,pp-bing,COG4995能够与KaiA发生相互作用。
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