酒类酒球菌31MBRβ-D-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

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葡萄酒的酿造过程包括两个阶段:酵母主导的酒精发酵和乳酸菌主导的苹果酸-乳酸发酵,苹果酸-乳酸发酵对葡萄酒香气物质的形成具有重要作用。参与苹果酸-乳酸发酵的主要乳酸菌是酒类酒球菌,它们不仅能耐受严苛的酒环境,而且自身含有丰富的酶类,其中β-D-葡萄糖苷酶是一类常见的水解酶,它是降解结合态香气物质的关键酶,能催化芳基或烃基与糖基之间的糖苷键水解,生成葡萄糖及挥发性物质。酒类酒球菌31MBR是国内常用的一株酿酒乳酸菌,具有良好的苹果酸乳酸发酵性能,且胞内可溶性β-D-葡萄糖苷酶酶活较高,对于水解键合态芳香物质具有重要作用。本文主要研究了酒类酒球菌31MBRβ-D-葡萄糖苷酶的提取分离纯化及部分酶学性质,主要研究结果如下:(1)在单因素试验的基础上采用响应面优化方法,确定了超声波破碎法提取酒类酒球菌31MBR胞内β-D-葡萄糖苷酶的最佳条件为:破碎总时间20min,破碎功率130W,菌体密度为OD600=2.0。按此方法得到粗酶液的总酶活为13.89U,显著高于用反复冻融法和玻璃珠法得到的酶活。将响应面方法用于超声波破碎条件的优化是可行的(2)酒类酒球菌31MBRβ-D-葡萄糖苷酶经硫酸铵盐析沉淀、Sepharosre-DEAE-FF阴离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层析纯化,所得到的酶液浓缩后经SDS-PAGE检验,可以得到单一条带,分子量约为38.9kDa。纯化后的β-D-葡萄糖苷酶与粗酶液相比,其比酶活由0.015U/mg提高到0.115U/mg,活力提高了7.67倍,酶的回收率为5.8%。(3)酒类酒球菌31MBRβ-D-葡萄糖苷酶的最适反应温度为45℃,最适pH在4.5到5.0之间;浓度为4%~16%的乙醇对酶活有较强的促进作用。葡萄糖、阿拉伯糖、木糖抑制酶活,半乳糖、蔗糖对酶活有一定促进作用。金属离子中,Cr2+、Mn2+、Li+对酶活有促进作用,Hg2+、Cu2+和Al3+对酶活有显著的抑制作用。以对硝基苯基-β-葡萄糖苷为底物时,Km和Vmax分别为1.05mmol/L和0.957nmol/min。
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