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目的： 人β干扰素是一类具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用的重要的细胞因子，属于Ⅰ型干扰素。天然IFN-β由166个氨基酸组成，含有一个N糖基化位点和三个Cys，其中第17位的Cys对保持IFN-β的空间结构无明显的作用，该Cys被Ser替代后不但对其生物学活性无影响，反而减少其与第141位Cys形成二硫键的机率，使其分子更加稳定。美国FDA已于1993年批准IFN-β(17Ser)用于治疗多发性硬化症。本实验目的之一就是克隆17位为Ser的人干扰素β突变体基因，同时保留了未突变的HuIFN-β基因，以便于比较。 目前，基因工程人IFN-β主要从CHO细胞和大肠杆菌中表达得到。大肠杆菌中表达的干扰素是以包涵体形式存在且无糖基化。在哺乳动物细胞CHO生产的干扰素表达量很低，费用高。甲基营养型酵母作为 第四军医大学博士学位论文一种新型外源基因表达系统，兼有原核细胞良好的可操作性和真核系统的翻译后加工的双重特点，是外源基因表达的理想宿主，本实验目的之二就是在毕赤酵母中构建表达IFN一p基因，为基因工程人IFN一p的生产探索一种新方法。 由于在毕赤酵母中表达的蛋白可能会出现N末端不均一现象，我们在表达质粒构建设计时采取了两种方法:第一，直接将目的基因插在信号肤pro序列中的LyS一Arg后面，删除了Glu--Ala一Glu--Ala重复序列，这样就不会造成这四个多余氨基酸在N末端残留;第二，我们设计了两个融合蛋白，将6个组氨酸编码（HIS·Tag）、FaCtorXa酶切位点编码和p千扰素基因顺序插入Glu一Ala一Glu--Ala重复序列后的Ec0RI位点。这样，既能简便快捷的用金属鳌合亲和填料纯化表达产物，又能通过FaCtorXa高效完全切除可能出现的N末端多余氨基酸和HisTag，得到目的蛋白，提高蛋白的利用率，这也是本研究目的之三。方法与结果:1.人干扰素p、17丝氨酸突变干扰素p基因及两者融合基因的克隆 与构建 本实验共扩增了四段IFN一p基因:利用PCR点突变方法，将工FN一p基因中17位CyS换为Ser，得到人旦干扰素突变基因（’7Ser一工FN一p）;利用基因重组技术，将6个组氨酸编码（HIS·Tag）和FactorXa酶切位点编码融合到突变后的‘7Ser一工FN一p基因5’端，得到17位丝氨酸突变体干扰素p融合基因（‘7Ser一 FuIFN一p）;为了进行比较，同时扩增了这两个基因未突变前的，17位为CyS的对应基因，即‘7Cys一IFN一p和，℃ys一FuIFN一p。将这四段基因分别与巴斯德毕赤酵母质粒pP工CgK或改构质粒pP工CgK’进行重组，转化大肠杆菌DHSQ，进行筛选鉴定。 经过PCR、酶切和DNA序列测定，证实四段基因均正确插入质粒中， 第四军医大学博士学位论文成功构建重组表达质粒。2.四种干扰素p重组质粒在毕赤酵母中的转染和表达 分别用Sacl、Sal工和Bgln线形化四个干扰素重组质粒，并用电穿孔法、LICI法和Pichia EasyCom了Kit三种方法转染毕赤酵母GSxls菌株，筛选G418浓度大于49/L的多拷贝整合转化子，用玻璃珠法和酶法提取酵母基因组DNA，PCR检测目的基因整合，并进行摇瓶表达和产物鉴定，对四段IFN一p基因表达结果进行初步分析。 实验确定Sall线形化，PIChia EasyComp’Kit转染，G418抗性大于49/L，His十Mut‘表型的毕赤酵母Gsz一5表达菌株。vsv攻击的wish细胞病变法测定摇瓶表达结果:融合表达产物要稍高于非融合产物;而17位Ser突变体表达产物要高于17位Cys产物。3.17位丝氨酸突变体干扰素p融合蛋白的发酵、纯化及产物分析 在巧升发酵罐上用补料一分批发酵方式进行高密度培养发酵试验，对发酵工艺进行考察。表达产物分别用金属鳌合介质、颜料亲和介质、离子交换填料进行初纯，用凝胶过滤填料、反相高效液相色谱进行精纯。对纯化产物进行免疫学、生物活性检测，同时进行糖基化、Fac torXa酶切分析。 制定了四个阶段、以补料一分批发酵方式进行高密度发酵生产Ivser一FuIFN一p的发酵工艺。发酵过程中酵母细胞湿重达到200一3009/L，实现高密度发酵的目的。经过24小时的甲醇诱导，表达产物活性达到最高7.5 x 104工U/ml（3.75 mg/L）。通过一步或多步初纯后，‘了Ser一Fu工FN一p的纯度能达到70一80%。再通过凝胶过滤柱层析去除高分子量蛋白后，其纯度可高达85%以上。纯化产物比活性IJ工U/mg，同时收集到分子量为28KDa，具有103工U/mg比活性的蛋白，初步推测它为连接部分信号肤的”Ser一FuIFN一p蛋白。 第四军医大学博士学位论文结论:1.本研究成功构建了四个干扰素p基因，并首次成功实现了17位Ser 突变人工FN一p在巴斯德毕赤酵母中表达。由于17位Ser突变能提 高IFN一p稳定性，对生产过程和临床应用十分有意义。2.首次设计在17位Ser突变HuIFN一p蛋白和a因子信号肤之间融合了6 个组氨酸（HIS·Tag）和Factor Xa酶切位点。这样，既能简便快捷 的用金属鳌合亲和填料纯化表达产物，又能通过FactorXa高效完全 切除可能出现的N末端多余氨基酸和HisTag，得到目的蛋白，提高 蛋白的利用率。3.实验