第一部分骨髓增殖性肿瘤JAK2、MPL、CALR基因突变特点及临床特征分析[研究背景和研究目的]骨髓增殖性肿瘤(MPN)是以骨髓中一系或多系髓系(粒系、红系、巨核系)细胞持续异常增殖为特征的一组克隆性造血干细胞疾病。主要包括真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)、原发性骨髓纤维化(PMF)和慢性粒细胞白血病(CML)。临床表现为一种或多种血细胞的异常导致患者有出血倾向、血栓形成和髓外造血。绝大多数(>85%)的MPN患者携带MPN启动或驱动基因突变,以JAK2 V617F基因突变最常见,其次为CALR基因突变,MPL基因突变比率最低。MPN亚型不同,突变基因频率、分布、临床表型及实验室指标也不同。JAK2、CALR、MPL等驱动基因的突变类型和突变负荷在判断MPN患者的预后方面具有重要的价值。如高JAK2 V617F突变负荷与高白细胞、高血红蛋白、巨脾及血栓事件发生率增高等显著相关,高负荷驱动基因突变的PV及ET患者进展为骨髓纤维化及白血病的风险增高。本研究旨在观察比较经典骨髓增殖性肿瘤患者驱动基因JAK2、CALR、MPL的突变特点、临床特征及实验室指标之间的差异,分析PV、ET、MF三种疾病的发病和临床特征与驱动基因之间的相互关系,为该疾病的治疗提供更加充分的依据。[研究方法]本研究采用系统性回顾的方法,通过门诊及电话随访收集2017年01月至2019年06月期间,在山东大学齐鲁医院就诊的MPN患者,共143例,其中PV 46例,ET49例,MF 48例,收集患者一般资料、临床表现、实验室检查、JAK2、MPL、CALR基因突变情况,以及疾病相关预后评分和治疗方案,并采用SPSS 25.0软件进行统计学分析,定义p<0.05为差异有统计学意义。[研究结果]本研究共纳入143例患者,其中PV 46例,ET 49例,MF 48例。我们观察到:1.JAK2 V617F基因总突变率为75.52%,在PV、ET、MF患者中的突变率分别为80.43%、71.43%、75.00%。JAK2 exon12基因突变仅见于3例PV患者。CALR基因总突变率为10.49%,其中ET患者突变率为20.41%,MF突变率为10.42%,PV患者中未检测到CALR突变。在PV、ET、MF三种疾病中,MPL突变检测均为阴性。未发现两种及以上基因突变共存的病例。2.在PV患者中,JAK2 V617F基因突变阳性与阴性患者相比:阳性患者发病年龄、白细胞计数、血小板计数、乳酸脱氢酶,以及脾脏增大和预后积分均明显高于阴性患者,具有显著统计学差异(p<0.05)。3.在ET患者中,JAK2 V617F基因突变阳性与阴性患者相比:JAK2 V617F基因突变阳性患者的红细胞计数、血红蛋白含量和血栓国际预后评分均明显高于阴性患者,具有显著统计学差异(p<0.05);JAK2 V617F基因突变阳性与CALR基因突变阳性患者相比:JAK2V617F基因突变阳性患者血栓预后积分更高,具有显著统计学差异(p<0.05);JAK2 V617F基因突变阳性与三阴性患者相比,JAK2 V617F基因突变阳性患者红细胞计数、血红蛋白含量及血栓国际预后评分均高于三阴性患者,纤维蛋白原低于三阴性患者,具有显著统计学差异(p<0.05);CALR基因突变阳性与三阴性患者相比,CALR基因突变阳性患者血红蛋白含量更高,纤维蛋白原更低,具有显著统计学差异(p<0.05)。4.在MF患者中,JAK2 V617F基因突变阳性与阴性患者相比:JAK2 V617F基因突变阳性患者白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白含量均高于突变阴性患者,具有显著统计学差异(p<0.05);JAK2 V617F基因突变阳性与CALR基因突变阳性患者相比,白细胞、血红蛋白、血小板各指标间差异无统计学意义(p>0.05);JAK2 V617F基因突变阳性与三阴性患者相比,JAK2 V617F基因突变阳性患者白细胞计数、红细胞计数及血红蛋白含量更高,具有显著统计学差异(p<0.05);CALR基因突变阳性与三阴性患者相比,各指标间差异无统计学意义(p>0.05)。[研究结论]1.在MPN患者中,驱动基因突变以JAK2 V617F基因突变最常见,其次为CALR基因突变,MPL基因突变比例最低,本研究143例患者,均未发现MPL突变。2.JAK2 V617F突变、CALR突变、MPL突变为互斥突变。3.在观察的143例PV、ET及MF患者中,均存在突变基因阴性患者,即“三阴性”患者,约占总数的11.89%,与文献报道基本相符。4.在PV患者中,JAK2 V617F基因是否突变与预后积分差异有统计学意义,提示基因突变与预后相关;ET患者中,JAK2 V617F基因突变、CALR基因突变与血栓预后积分差异有统计学意义,提示基因突变与血栓形成风险相关。5.MPN亚型不同,突变基因频率、分布、临床表型及实验室指标也不同。第二部分 基于二代测序的骨髓增殖性肿瘤基因突变模式分析[研究背景和研究目的]在MPN中,除驱动基因外,一些非驱动基因突变对判断MPN患者的预后亦有一定的价值。ASXL1、SRSF2、EZH2、IDH1/2基因突变被定义为“高危分子遗传学基因突变(HMR)”,是MPN患者预后不良的标志,携带至少1个上述基因突变被定义为高分子风险状态,患者总生存期(OS)缩短,进展为AML的风险增大。携带超过1个高危分子异常的患者预后更差,文献报道该类患者中位总生存期显著低于携带1个或无突变的患者(分别为2.6年、7.0年和12.2年)。随着二代测序技术的广泛开展,临床上已逐渐开展MPN患者非驱动基因突变的检测,但仍缺乏系统性大宗病例分析,故而非驱动基因对MPN疾病临床特征、治疗、预后的影响有待于深入研究。为了向MPN诊断和分层治疗提供更多的分子遗传学支持,结合NCCN指南推荐及我院血液病实验室实际检测手段,我们对57例MPN患者进行了 38个MDS/AML/MPN相关基因的靶向二代测序,进一步了解不同驱动基因及非驱动基因突变情况与MPN患者的临床特征、治疗、预后以及与生存之间的关系,以期为我国MPN数据库提供更丰富的数据资料,为个体化治疗和精准医疗提供理论支持。[研究方法]本研究采用系统性回顾的方法,通过门诊及电话随访收集2017年01月至2019年06月期间在山东大学齐鲁医院就诊并进行二代测序的MPN患者,共57例,其中PV 14例,ET 17例,MF 26例。收集患者一般资料、临床表现、实验室检查、驱动基因和非驱动基因突变情况,以及疾病相关预后评分和治疗方案,并采用SPSS 25.0软件进行统计学分析,定义p<0.05为差异有统计学意义。[研究结果]本研究共纳入57例患者,其中PV 14例,ET 17例,MF 26例,我们观察到:1.PV患者共14例,非驱动基因突变检测均为阴性。2.在所观察的17例ET患者中,有10例患者检测到非驱动基因突变,突变频数为0-5。ASXL1、TP53突变频率均为17.65%,TET2、U2AF1、DNMT3A、SF3B1突变频率均为11.76%,SRSF2突变频率为5.88%。突变类型以点突变、插入/缺失突变为主。而指南推荐的CSF3R、EZH2、IDH1/2、SH2B3、ABL1、CBL未检测到突变。3.在所观察的26例MF患者中,有17例患者检测到非驱动基因突变,突变频数为0-4。ASXL1突变频率为46.15%,SF3B1突变频率为15.38%,TP53、TET2、SRSF2 突变频率均为 7.69%,CSF3R、IDH1、U2AF1、NRAS、KRAS、CEBPA、ETV6、AML1突变频率均为3.85%,未检测到EZH2、SH2B3、ABL1、CBL、DNMT3A基因突变。所检测到的突变中,突变类型以点突变、插入/缺失突变为主。分析这些发生非驱动基因(ASXL1、SF3B1、TET2、SRSF2、TP53、CSF3R、IDH1、U2AF1)突变的MF患者临床特点,各指标间差异无统计学意义(p>0.05)。4.26例MF患者中,有4例转化为白血病,二代测序结果显示多个非驱动基因突变或高危分子遗传学基因,疾病进展快,且对现有治疗反应不佳。[研究结论]1.观察的14例PV患者,未检测到非驱动基因突变;58.82%(10/17)的ET和65.38%(17/26)的MF患者存在至少一个非驱动基因突变,半数以上患者只含一个突变。2.17 例 ET 和 26 例 MF 患者中,发现 ASXL1、TET2、SRSF2、TP53、U2AF1、SF3B1等多种重现性基因突变,以ASXL1突变比率为最高,突变类型主要表现为点突变、缺失突变和插入突变,以点突变比例最高。3.非驱动基因突变与疾病进展及转化相关,依据MIPSS70/MIPSS70-Plus评分,对新诊断的患者进行预后分层,选择个体化的治疗方案。