目的:我们在最近的一项国家自然科学基金项目(DNA甲基化在鉴别同卵双生个体中的研究,No.30973364)的研究中,发现人类血液样本线粒体DNA控制区的一段序列甲基化水平为2%~34%,并在同卵双生子(monozygotic twins,MZT)之间存在较大差异,可以鉴别多达31.93%的MZT,且具有明显的组织差异性,其在唾液样本中得甲基化程度几近于0。这些结果引发了我们对于mt DNA甲基化这一研究领域的关注和思考。追踪有关mt DNA甲基化研究的文献,发现该领域的研究较少,并且存在争议。最早关于mt DNA甲基化的研究报道出现在30年前,Dawid对青蛙和Hela细胞的研究表明,二者均不存在mt DNA甲基化。之后有研究发现在小鼠、仓鼠、人类等种属,应用甲基化敏感性限制性内切酶分析均检测到低水平的mt DNA甲基化。近来有研究报道mt DNA甲基化与多种疾病相关,但也有报道认为mt DNA几乎没有甲基化。这些存在矛盾的结果可能与mt DNA甲基化检测的方法不同有关。亚硫酸氢盐转化焦磷酸测序技术是目前公认的检测DNA甲基化的金标准,能够对每一个Cp G位点进行精确定量,并通过内质控监测亚硫酸氢盐转化率而具有较高的准确性。综上,本研究拟应用亚硫酸氢盐转化焦磷酸测序技术对线粒体甲基化进行进一步研究,将检测覆盖mt DNA控制区、13个蛋白质基因、2个r RNA基因及22个t RNA基因的Cp G位点的甲基化情况,建立人类线粒体基因组DNA甲基化精确定量检测方法,绘制一张较完整的人类线粒体基因组甲基化图谱,为mt DNA甲基化遗传标记的法医学应用及临床应用研究奠定基础。方法:按照知情同意原则,采集健康个体外周血样本154例,收集漱口水样本24例,每位受试者均签署知情同意书。对线粒体基因组Cp G位点进行生物信息学分析,发现共有435个Cp G位点且分布不均匀,其中轻链复制起始点(OL)(5721~5798bp)处分布密度最高,t RNA基因分布密度最低。根据上述生物信息学分析结果,应用Assay Design引物设计软件分区段设计扩增引物和测序引物,本研究共设计20对扩增引物及相应的20条测序引物,可检测20条序列共83个Cp G位点甲基化程度。20条序列依次命名为MT1~MT20。提取血液样本及漱口水样本的全基因组DNA,用Bam HⅠ处理DNA将mt DNA的环状结构打开,进行亚硫酸氢盐转化。已转化的DNA为模板,PCR扩增20条特异性mt DNA序列,对扩增产物进行焦磷酸测序,获得各Cp G位点的甲基化定量值。本实验通过MT1、MT2、MT3、MT4四条序列的分析比较开环组与未开环组检测情况的差异。应用SPSS13.0软件进行统计分析,分析方法有:配对t检验、方差分析、秩和检验等方法进行统计学分析。结果:1线粒体DNA环状结构对亚硫酸氢盐转化焦磷酸测序的影响1.1.1线粒体DNA环状结构对焦磷酸测序通过率的影响通过对65~154个血液样本的检测,我们发现4条序列MT1、MT2、MT3、MT4在开环组的焦磷酸测序通过率分别为78.95%、97.32%、97.73%、90.26%,而在未开环组的通过率分别为80.95%、84.62%、64.52%、47.89%。除MT1外,其余3条序列的通过率在开环组与未开环组之间均具有显著性差异,且未开环组的通过率均明显低于开环组。进一步分析测序失败的原因,发现在未开环组,除MT2外,其余3条序列内质控不通过所占比例均达80%以上,而在开环组,测序失败的主要原因是峰信号过低。表明在血液样本中不开环对亚硫酸氢盐的转化有显著影响,转化效率明显低于开环组,导致焦磷酸测序的通过率明显降低。1.1.2漱口水样本检测的漱口水样本数为14~24个。所检测的4条序列MT1、MT2、MT3、MT4在开环组的焦磷酸测序通过率分别为87.50%、82.35%、94.12%、87.50%,而在未开环组的通过率分别为90.00%、87.50%、87.50%、94.44%,两组之间无统计学差异。漱口水样本未开环组DNA的测序通过率明显高于血液样本未开环组,而且与对应的开环组无显著差异,而且在测序未通过的样本中,并没有发现转化不完全导致的测序失败,反而在开环组发现了两例转化不完全。该结果表明线粒体DNA环状结构对漱口水样本亚硫酸氢盐转化的影响较小。1.2线粒体DNA环状结构对甲基化定量数值的影响1.2.1血液样本在血液样本中,虽然未开环组的测序通过率较低,但仍在47%以上,那么这些测序成功的样本甲基化程度与开环组相比是否存在差异呢?我们对二者进行了分析比较,发现4条序列在未开环组的平均甲基化程度分别为11.65%±0.29%,3.58%±0.27%,5.68%±0.20%,7.21%±0.27%,而在开环组的平均甲基化程度分别为1.16%±0.09%,1.68%±0.10%,0.32%±0.05%,0.78%±0.09%,Wilcoxon秩和检验结果表明二者存在显著差异,即开环组甲基化水平显著低于未开环组,提示对于血液样本线粒体DNA甲基化的检测,如果采用亚硫酸氢盐转化的方法,必须要先进行开环处理,否则会过高地估计线粒体DNA甲基化水平。1.2.2漱口水样本在漱口水样本中,对开环组和未开环组检测成功的样本的甲基化程度进行比较分析,4条序列在未开环组的平均甲基化程度分别为1.17%±0.25%,1.79%±0.35%,0.47%±0.17%,1.06%±0.28%,而在开环组的平均甲基化程度分别为1.38%±0.21%,2.14%±0.29%,0.69%±0.18%,0.93%±0.22%,Wilcoxon秩和检验结果表明二者间的甲基化水平无明显差异。该结果进一步证实漱口水样本线粒体DNA的闭合环状结构对亚硫酸氢盐转化的影响较小,因此对甲基化定量数值的影响也不大,开环与否检测结果无明显差异。2人类线粒体基因组DNA甲基化谱分析应用上述建立的Bam HⅠ处理及亚硫酸氢盐焦磷酸测序方法检测了14个无关个体血液样本及漱口水样本的线粒体基因组甲基化,包括D环区的16个Cp G位点、2个r RNA基因区的21个Cp G位点、6个蛋白质基因的46个Cp G位点,结果发现,无论血液样本还是漱口水样本,无论D环区还是编码区,这些位点在14个样本的平均甲基化水平为0%~6%,且大部分为0%~2%,意味着几乎没有甲基化的发生。结论:本研究首次采用亚硫酸氢盐焦磷酸测序技术检测人类线粒体基因组DNA甲基化,发现mt DNA的环状结构影响亚硫酸氢盐转化效率,进而影响后续的焦磷酸测序通过率,而且即使测序通过,其甲基化定量值明显高于实际值,导致mt DNA甲基化程度被过高估计。这种现象在血液样本表现突出,而在漱口水样本却未发生。应用本研究建立的Bam HⅠ处理及亚硫酸氢盐焦磷酸测序方法分析人类线粒体基因组83个Cp G位点甲基化,发现无论血液样本还是漱口水样本,无论D环区还是编码区,其平均甲基化水平均为0%~6%,意味着几乎没有甲基化的发生。