论文部分内容阅读
目的：研究Th17/Treg细胞及其失衡在日本血吸虫病肝虫卵肉芽肿形成中的作用，完善日本血吸虫致病机制，为血吸虫病治疗提供新的靶标。方法：本实验采用6~8周龄的Balb/c小鼠构建日本血吸虫病感染模型，利用FCM检测不同时间点（0w，2w，4w，6w，8w）小鼠肝、脾组织中Th17/Treg细胞数目、比例的变化；Trizol法提取肝组织中mRNA，Real-time PCR检测不同时间点小鼠肝组织中IL-6、IL-10、IL-17、IL-23、RoR-γt及Foxp3mRNA的表达水平；ELISA法检测各时间点小鼠血清中IL-6、IL-17、IL-23及TGF-β表达水平，HE和Masson染色法检测各组小鼠肝组织病理变化情况。用日本血吸虫尾蚴感染新西兰兔，提取、纯化及制备SjSEA，分离纯化及培养Balb/c小鼠脾脏混合细胞，用SjSEA刺激细胞，Real-time PCR检测不同时间点RoR-γt及Foxp3mRNA的表达水平，ELISA法检测不同时间点细胞培养上清液中IL-6、IL-17、IL-23及TGF-β表达水平。结果：（1）体内实验：成功建立日本血吸虫病肝虫卵肉芽肿小鼠模型，各组小鼠肝组织病理学检测结果显示，肝虫卵肉芽肿面积及肝脏胶原沉积百分比随感染时间延长而增加，正常组分别为0和1.50±0.20，第2w分别为0和2.05±0.34，第4w分别为0.098±0.010和12.60±1.30，第6w分别为0.156±0.017和18.3±2.03，第8周为最大值0.219±0.020和23.47±2.94。FCM结果显示：正常对照组小鼠肝组织中IL-17A+Th17细胞占CD4+T细胞比例为0.74±0.09%，感染组（2w、4w和6w）分别为4.87±1.03%、9.64±0.98%和5.24±2.75%，IL-17F+Th17细胞在正常组占肝CD4+T细胞比例为1.19±0.51%，感染组（2w、4w和6w）分别为5.54±1.64%、9.05±0.89%和6.58±3.99%，感染组（2w、4w和6w）与正常组相比Th17细胞比例显著升高，p<0.05，差异有统计学意义。感染第8w时，IL-17A+Th17细胞占CD4+T细胞比例为1.64±0.99%，IL-17F+Th17细胞占2.43±1.79%，与正常组比较均无统计学意义，IL-17A+Th17细胞与IL-17F+Th17细胞均在感染4w时达峰值。正常对照组Treg细胞占肝CD4+T细胞比例为0.07±0.02%，感染组（4w、6w和8w）分别为11.27±3.05%、12.28±6.52%和6.51±2.15%，与正常组相比显著升高（p<0.05），第6周达高峰。小鼠脾脏中IL-17A+Th17细胞占CD4+T细胞比例在正常组为1.73±0.39%，感染第4w为13.50±2.14%（p<0.05），IL-17F+Th17细胞占CD4+T细胞比例在正常组为1.95±0.47%，感染组（2w、4w）分别为3.98±0.64%和12.92±2.01%，与正常组相比显著升高（p<0.05），两者均在感染第4w时达高峰，其它感染组（6w和8w）与正常组比较无统计学差异。Treg细胞占脾脏CD4+T细胞比例在正常组为0.52±0.20%，感染组（2w、4w）分别为2.68±0.81%和10.53±1.57%，与正常组相比显著升高（p<0.05），第4w达高峰。血吸虫感染0w~8w间Th17/Treg在肝脏的比值变化范围为，0.63±0.10~27.14±6.90，在脾脏为2.51±0.11~11.19±0.42，Th17与Treg细胞百分比变化的相关系数在脾组织为r=0.99，而在肝组织仅为0.46，表明肝脏病变组织Th17/Treg失衡严重。Real-time PCR检测结果显示，ROR-γt mRNA和Foxp3mRNA在肝组织中均有表达，感染第4w ROR-γt mRNA表达含量达峰值，为1.66±0.38，与正常对照组（1.00±0.02）相比，差异具有统计学意义(P<0.05)；感染4w、6w和8w Foxp3mRNA表达量分别为64.8±13.44、107.72±26.19和35.49±5.97，与正常组（10.12±4.08）比较，差异具有统计学意义，P<0.05，第6w时达到最高值。IL-6、IL-10、IL-17和IL-23mRNA在肝组织中的检测结果显示，感染组（6w和8w）IL-6mRNA相对含量分别为21.37±8.87和20.34±12.59，与正常组（0.79±0.26）比较，P<0.05，第6w时达峰值；感染组（4w、6w和8w）IL-10mRNA相对含量分别为5.98±1.08、6.03±1.06和11.21±4.79，与正常组（0.46±0.50）比较，P<0.05，8w达峰值；感染组（4w、6w和8w）IL-17mRNA相对含量分别为7.30±1.35、17.69±2.07和39.74±7.27，与正常组（0.99±0.18）比较，P<0.05，8w时达峰值；感染组（4w、6w和8w）IL-23mRNA相对含量分别为313.64±59.57、298.29±77.71和240.46±58.38，与正常组（4.41±1.41）比较，P<0.05，4w时达峰值。ELISA检测小鼠血清中相关细胞因子，结果显示感染组（2w、6w）IL-6表达量分别为1582.44±135.98和810.23±79.28，与正常组（560.99±95.51）比较具有显著性差异，p<0.05，第2w达最高值；感染组（2w、4w）IL-17表达量分别为773.67±51.90和950.24±37.94，与正常组（631.28±64.26）比较显著升高，p<0.05，第4w达到高峰；感染组（2w、4w、6w和8w）IL-23表达量分别为1530.31±176.96、1761.824±90.57、2585.37±390.41和2938.73±317.24，与正常组（798.03±192.94）比较显著升高，p<0.05，第8w时达到高峰；感染组（4w、6w、8w）TGF-β表达量分别为107.39±7.07、150.04±12.26和188.87±32.10，与正常组（59.67±2.83）比较显著升高，p<0.05，在第8w时达到高峰。（2）体外实验：SjSEA可诱导脾脏混合细胞表达RoR-γt及Foxp3mRNA，SjSEA刺激后RoR-γt mRNA表达量在12h、24h和36h与PBS组比较均有显著性差异，p<0.05，Foxp3mRNA表达量在12h和36h与PBS组比较有显著性差异，p<0.05。RoR-γt mRNA在36h达峰值，为3.207±0.600，Foxp3mRNA在12h达峰值，为1.903±0.090。ELISA结果发现，SjSEA可诱导与Th17细胞分化相关的细胞因子IL-6、IL-23和TGF-β产生，IL-6在36h时达峰值（913.83±90.00），IL-23在24h时达峰值（1387.81±110.00）；TGF-β在3h升高，24h达峰值（202.27±39.80）；SjSEA可诱导与Th17功能相关的细胞因子IL-17的产生，随着刺激时间延长逐渐升高，48h时达最高值，为1150.07±108.22，其结果表明SjSEA抗原可能在体外激活和诱导Th17细胞分化。结论：(1)日本血吸虫感染后可诱导Th17细胞应答，肝组织内Th17/Treg失衡在日本血吸虫病肝虫卵肉芽肿形成中起重要作用。(2)日本血吸虫感染后Th17/Treg失衡主要存在于肝脏，脾脏Th17和Treg细胞均升高，但比例失衡程度远低于肝脏，说明Th17细胞主要在病变肝组织发挥免疫病理损伤作用。(3) SjSEA可诱导脾脏混合细胞表达IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β、RoR-γt及Foxp3，可能与其在体外激活和诱导Th17细胞分化有关。