第一部分氯胺酮对乳鼠脑皮质和海马神经细胞凋亡的影响目的探讨临床上常用的麻醉剂氯胺酮对乳鼠体内脑皮质和海马神经细胞凋亡的影响。方法新生7日龄SD大鼠15只,随机分成3组：氯胺酮低剂量组、高剂量组分别腹腔注射20 mg/kg、80 mg/kg氯胺酮,对照组给予等量的生理盐水。注射后10分钟用1ml皮试针经左心室采0.5m1血进行血气分析。注射后24h,比较三组大鼠的体重增长情况,取脑组织作HE染色,用TUNEL法检测脑细胞的凋亡情况,用免疫组织化学法检测Caspase-3的表达水平。结果三组大鼠血气分析结果间无统计学差异,三组大鼠体重增长间无统计学差异。与对照组比较,皮质区的凋亡情况为：氯胺酮低剂量组的凋亡细胞数的差异无显著性意义(P>0.05),神经细胞核固缩和Caspase-3阳性细胞数增多(P<0.05)；氯胺酮高剂量组的凋亡细胞数、神经细胞核固缩及Caspase-3阳性细胞数显著性增加(P<0.05)。与对照组比较,海马区的凋亡情况为：氯胺酮对海马区凋亡的影响的差异无显著性意义,氯胺酮低剂量组和高剂量组的神经细胞核固缩数、凋亡细胞数和Caspase-3阳性细胞数与对照组均无显著性差异(P>0.05)。结论氯胺酮可诱发体内乳鼠脑皮质神经细胞的凋亡。氯胺酮诱发的在体内乳鼠脑皮质神经细胞的凋亡呈剂量相关性,低剂量氯胺酮诱发的乳鼠脑皮质神经细胞凋亡较轻微,高剂量的氯胺酮诱发的脑皮质神经细胞的凋亡较严重。氯胺酮诱发在体内的乳鼠脑皮质神经细胞的凋亡与乳鼠的营养摄入以及乳鼠的缺氧无关。氯胺酮对在体内的海马区神经细胞的凋亡的影响并不显著。第二部分氯胺酮对脑皮质神经细胞凋亡影响的机制探讨目的探讨氯胺酮对体外培养的脑皮质神经细胞凋亡的影响及其机制。方法取新生24h内SD大鼠的大脑皮质进行分离和体外原代培养,用特异性结合于神经细胞的带荧光标记的破伤风毒素染色标记鉴定神经细胞。用相差倒置显微镜及Hochest33258荧光染色观察细胞凋亡的形态学变化,测定乳酸脱氢酶(1 actate dehydrohenase, LDH)释放率表示细胞的死亡率,用Hoches33258荧光染色方法检测细胞凋亡率,用Western Blotting法检测并半定量分析Akt和GSK-3β的磷酸化水平。用100μM的氯胺酮处理至24小时,与空白对照组对比观察氯胺酮对原代培养的大鼠皮质神经细胞凋亡的影响以及氯胺酮处理后不同时点细胞凋亡的情况。加入100 u M氯胺酮0、0.5、1、6、12、18小时后检测GSK-3β和Akt磷酸化水平与空白对照组比较。分别以1、10、100μM的氯胺酮处理皮质神经细胞0.5小时,比较不同剂量的氯胺酮对Akt磷酸化水平的影响。比较三种浓度(5μM、25μM和50 u M)的GSK-3β特异性小分子抑制剂SB-415286对氯胺酮诱导的皮质神经细胞凋亡率和LDH相对释放量的影响。比较两种浓度(5ng/ml和50ng/ml) IGF-1对氯胺酮诱导的皮质神经细胞凋亡及GSK-3β和Akt磷酸化水平的影响。结果体外培养至第6天的乳鼠脑皮质神经细胞用免疫荧光法鉴定神经细胞纯度为90%以上。100 u M的氯胺酮处理12小时开始出现形态学变化,胞体变圆,神经细胞突起断裂；随着氯胺酮处理的时间增加,神经细胞胞体缩小变圆,结构不清,边界模糊,神经细胞突起中断不连续；24小时神经细胞胞体变小,呈空泡状,突起和网状结构基本消失。以100μM氯胺酮处理细胞致神经细胞凋亡数目呈时间依赖性地增加,在处理后24小时凋亡细胞数可达41.8%,与对照组相比差别具有统计学意义。100 u M的氯胺酮引起的神经细胞LDH释放量增加在18小时后出现,在处理24小时时神经细胞LDH相对释放量约升高为对照组的2倍。100μM的氯胺酮处理皮质神经细胞0.5、1、3、6和12小时后,GSK-3βSer9位点的磷酸化水平分别是对照组的81.6±3.36%、57.0±2.24%、53.2±1.92%、51.6±2.30%和52.6±3.04%,与0小时对照组相比有统计学差异,至18小时回升至89.2±2.59,反映加入氯胺酮后1-18小时GSK-3β持续被激活。三种浓度(5μM、25μM和50μM)的SB-415286预孵2小时,神经细胞凋亡率分别降至51.2±2.8%、40.1±3.5%和34.9±3.3%,与氯胺酮组比较差别有统计学意义(P<0.05),提示抑制GSK-3β的活性能拮抗氯胺酮诱导的神经细胞凋亡。100 u M的氯胺酮处理皮质神经细胞,Akt Ser473磷酸化水平在0.5h时下降,为对照组的67.2±2.42%；1、6、12小时持续维持在低水平,分别为49.6±3.01%、30.8±1.94%和35.3±2.87%,18h回升60.4±2.33%,与对照组相比差别具有统计学意义(P<0.05),反映加入氯胺酮后1～18小时Akt的活性持续被抑制。5ng/ml和50ng/ml的IGF-1预孵2小时后加入终浓度为100μM的氯胺酮处理24小时后,神经细胞凋亡率较氯胺酮组降低,分别为27.8±0.99%和14.7±1.37%,提示激活Akt可拮抗氯胺酮诱导的皮质神经细胞凋亡；GSK-3βSer9磷酸化水平分别为对照组的199±9.2%和212±11.5%,Akt Ser473的磷酸化水平升高至对照组的229±11.2%和和232±17.1%,GSK-3βSer9与Akt Ser473磷酸化水平的变化具有一致性,提示GSK-3β和Akt参与了氯胺酮诱导的皮质神经细胞凋亡,氯胺酮可能通过抑制Akt,进而激活GSK-3β,最终诱导皮质神经细胞凋亡。结论氯胺酮可诱发体外培养的乳鼠脑皮质神经细胞的凋亡。氯胺酮增加乳鼠脑皮质神经细胞凋亡,并伴有以细胞皱缩、细胞核浓缩或碎片形成等为特征的形态学改变。胰岛素生长因子-1可完全阻断氯胺酮诱发的乳鼠皮质神经细胞凋亡。氯胺酮降低了Akt的磷酸化水平。氯胺酮通过激活GSK-3β诱导乳鼠皮质神经细胞凋亡。第三部分参附注射液预处理对氯胺酮诱发的脑皮质神经细胞凋亡影响目的研究参附注射液预处理对氯胺酮诱发的乳鼠在体内脑皮质神经细胞凋亡的影响。方法新生7日龄SD大鼠15只,随机分成3组,对照组以等量生理盐水替代氯胺酮腹腔内注射,氯胺酮组以腹腔内注射80mg/kg氯胺酮,参附预处理+氯胺酮组在氯胺酮注射前连续4天腹腔内注射参附注射液10ml/kg。氯胺酮注射后24h,取脑组织作HE染色,用TUNEL法检测脑细胞的凋亡情况,用免疫组织化学法检测Caspase-3的表达水平。结果与对照组相比,氯胺酮组和参附预处理+氯胺酮组的核固缩数增多,但三组间无统计学差异(p>0.05)。与对照组比较,氯胺酮组和参附预处理+氯胺酮组细胞凋亡率显著升高(p<0.05)；与氯胺酮组比较,参附预处理+氯胺酮组细胞凋亡率显著下降(p<0.05)。氯胺酮组和参附预处理+氯胺酮组Caspase-3阳性细胞数与对照组相比显著升高(p<0.05),参附预处理+氯胺酮组Caspase-3阳性细胞数与氯胺酮组相比显著下降(p<0.05)。结论参附注射液可减少氯胺酮诱发的乳鼠脑皮质细胞凋亡的发生,抑制Caspase-3的激活可能是其作用机制之一。。全文结论氯胺酮可诱发在体内乳鼠脑皮质神经细胞的凋亡。氯胺酮诱发的在体内乳鼠脑皮质神经细胞的凋亡呈剂量相关性,低剂量氯胺酮诱发的乳鼠脑皮质神经细胞凋亡较轻微,高剂量的氯胺酮诱发的脑皮质神经细胞的凋亡较严重。氯胺酮诱发在体内的乳鼠脑皮质神经细胞的凋亡与乳鼠的营养摄入以及乳鼠的缺氧无关。氯胺酮对在体内的海马区的凋亡的影响的差异无显著性意义。氯胺酮可诱发体外培养的乳鼠脑皮质神经细胞的凋亡。氯胺酮增加乳鼠脑皮质神经细胞的凋亡,并伴有以细胞皱缩、细胞核浓缩或碎片形成等为特征的形态学改变。胰岛素生长因子-1可完全阻断氯胺酮诱发的乳鼠皮质神经细胞凋亡。氯胺酮降低了Akt的磷酸化水平。氯胺酮通过激活GSK-3β诱导乳鼠皮质神经细胞凋亡。参附注射液可减少氯胺酮诱发的乳鼠脑皮质细胞凋亡的发生,抑制Caspase-3的激活可能是其作用机制之一。