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利用T-DNA介导的启动子诱捕载体(promotertrapvector)转化拟南芥,我们本研究分离到了一个多效突变体,称为155系。本文在整体水平、组织水平和细胞水平上深入研究了该突变体的表型和结构的变化、通过突变体与野生型之间的杂交对其遗传背景进行了分析,并运用分子生物学手段对突变体相关基因进行了克隆和定位,初步探讨了该基因的表达模式和功能。
1.155突变造成了植株形态发育方面的许多变异,包括:子叶圆而肥厚,下胚轴粗短,根长缩短,成熟植株叶片数目减少,叶柄缩短,叶片远基端叶尖向下卷曲,叶色深绿;从营养生长到生殖生长的转化延迟7天左右,整个植株的高度明显低于野生型。
2.突变体茎顶端分生组织(shootapicalmeristem,SAM)的石蜡切片观察表明:1)10d苗龄155的SAM扁平,不像野生型形成拱形;2)21d时,155的SAM和C24一样呈拱形,但是SAM的两侧PZ(peripheralzone)较野生型平坦。此外,原套第二层(L2)细胞呈非垂周分裂;3)第30d时,突变体的SAM依然停留在营养型分生组织阶段,而野生型的SAM已经分化为生殖型(花序茎)分生组织。
3.与野生型相比,155的子叶脉序也发生了改变:子叶维管脉络有2-6个小的末端脉序从中脉或侧脉延伸出来,远基端有额外的闭合或非闭合环,并且子叶脉络中环的形状和位置不规则排列。
4.组织化学检测表明,GUS基因在155SAM的肋状区和叶原基特异性地表达。
5.遗传分析表明,155系是一个由细胞核基因控制的单基因隐性突变体。
6.155的生长发育特性与激素关系的研究结果显示,插入突变造成了155对激素响应状态的微弱改变,IAA和GA3对C24下胚轴伸长的抑制均比155更为明显。但是,155对这两种激素响应的总体趋势和C24是一致的。
7.用TAIL-PCR对突变体的相关基因进行了克隆,通过核苷酸序列比对分析发现,该基因位于第Ⅳ号染色体上,与热激蛋白101(HSP101)相关。
8.通过RT-PCR对正常生长条件下野生型和突变体中HSP101相关蛋白基因的表达水平进行了初步的检测,发现在正常生长条件下两者的表达水平基本一致。但在热激处理后,突变体中该基因的表达未明显检测到,还有待于进一步验证。另外还发现,155对高温敏感,在30℃生长条件下,155的生长受到严重抑制,不能进入生殖生长阶段。
以上实验结果表明,T-DNA插入确实引起了插入位点基因功能的改变,进而导致了突变体一系列形态、结构和发育的改变,说明该基因编码的HSP101相关蛋白可能是调节拟南芥正常生长发育信号通路中极为重要的一员,通过参与细胞间的信号转导及调控而影响子叶维管发育,茎顶端分生组织的形成与维持以及整体形态的发育。