目的 构建重组人骨桥蛋白(recombinant human osteopontin，rhOPN)表达载体，诱导表达并对表达产物进行分离纯化。制备多克隆抗体并分离纯化，建立双抗夹心酶联免疫吸附实验(Sandwich enzyme linked immunoabsorbent assy，Sandwich ELISA)的方法。方法 收获培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)，提取总RNA，进行RT-PCR获得人骨桥蛋白的cDNA，经BamHI／SalI双酶切，得到插入片段。同样用双酶切处理载体DNA，连接插入片段和载体，转化到大肠杆菌中。挑选阳性克隆经酶切鉴定和测序后，进行诱导表达。用Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化融合蛋白，并用PreScission Protease进行裂解。用裂解后的rhOPN作为抗原免疫家兔，制备多克隆抗体，结合离子交换层析方法和饱和硫酸铵沉淀法纯化IgG，用过碘酸钠改良法进行偶联IgG与辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)，并建立Sandwich ELISA方法。 结果 构建的表达载体经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA测序并与GenBank比对，证明所构建的重组质粒含有opn插入片段。诱导后表达一新的蛋白，该蛋白占细菌菌体总蛋白的16.7％。亲和层析的洗脱溶液中是分子量为85 Kd的融合蛋白GST-OPN，该蛋白裂解为分子量58 Kd的rhOPN和26 Kd的GST。间接ELISA方法测定制备的多克隆抗体效价大于1：6400，IgG的纯度为97％，将IgG和HRP偶联。结论 成功构建重组人骨桥蛋白表达载体，裂解获得非融合的重组人骨桥蛋白；制备、分离纯化多克隆抗体，对其进行标记并建立Sandwich ELISA方法。