白细胞介素12(interleukin-12, IL-12)由P40和P35两个亚基通过多对二硫键构成复杂的异二聚体,是连接先天固有免疫与后天获得性免疫的桥梁,被认为是免疫系统抗病毒的核心调控因子。rhIL-12 (recombinant human interleukin-12)作为传染性疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病和哮喘等的治疗药物,国外已进入临床试验,而国内对rhIL-12的研究尚处于临床前阶段。我们的体外初步药效学研究显示,rhIL-12与rHBsAg (recombinant hepatitis B surface antigen)联合应用,通过第3和第1信号共同调节慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者的免疫应答,可能是一个崭新的、有前途的抗HBV (hepatitis B virus)治疗策略。为此,我们对rhIL-12单独及与rHBsAg联合应用治疗CHB进行了系统的药理学研究,期望研发一种治疗CHB的新生物制剂。前期研究将IL-12的P35和P40亚基构建于同一载体中,成功获得稳定、高效表达rhIL-12蛋白的CHO (Chinese hamster ovary)工程细胞株,经过发酵罐连续培养、上清液纯化,得到纯度>95%的rhIL-12。进行了组分含量、理化性质、生物学活性、免疫学性质、纯度和杂质以及污染物的鉴定等全面质量研究,所制备的rhIL-12符合基因工程药物质量标准。本论文包括rhIL-12单独及联合rHBsAg用于CHB治疗的临床前主要药效学及其机制和药代动力学研究。1主要药效学1.1体外药效学以IFN-γ(interferon-gamma)作为评价rhIL-12生物活性的主要指标。健康人PBMCs (peripheral blood mononuclear cells)经0.005、0.01、0.1、0.5、1.0、2.0、10、80 ng/ml浓度rhIL-12刺激后,IFN-γ分泌增加,量-效曲线呈典型的S型,ED50 (effective dose 50)为0.0863±0.0032 ng/ml, R2=0.999。在0.01～1.0 ng/ml范围内,rhIL-12剂量依赖性增加IFN-γ分泌,故rhIL-12的优选剂量为0.01、0.1、1.0ng/ml。以1.0 ng/ml rhIL-12刺激健康人PBMCs,24h、48h、72h、96h和120h等5个时间点IFN-γ测定水平,结果表明,24h即有IFN-γ产生,随着时间的延长,IFN-γ含量增加,72h或96h达到峰值。综合分析并参考文献,优选72h作为IFN-γ的检测点。采用体外PBMCs诱生IFN-γ方法,比较本研究所用rhIL-12-GZ(广州恺泰生物科技有限公司产品)与国际标准品(rhIL-12-IS,购自英国NIBSC)生物活性的差异。在0.005、0.02、0.078、0.313、1.25、5.00、20.00、80.00ng/ml浓度范围内,rhIL-12-GZ与rhIL-12-IS量效曲线均呈典型的S型,且两曲线吻合良好(相关系数R=0.991, P=0.000)。0.005-1.25 ng/ml浓度对数和IFN-γ含量测定吸光度所作量效曲线呈线性,回归方程分别为rhIL-12-GZ:Y=3.016+1.147X; rhIL-12-IS:Y=3.030+1.048X,且两条回归直线也非常吻合(P=0.217)。上述结果说明本品生物活性与国际标准品基本相当。为研究rhIL-12对健康人及CHB患者PBMCs诱生IFN-γ和IL-4作用,取20名健康人和68名CHB患者(免疫耐受期21名、免疫清除期22名、非活动性HBsAg携带期19名)外周血,制备PBMCs,加入rhIL-12孵育72h。设rhIL-12低、中、高(0.01,0.1, 1.0ng/ml)三个浓度组及生理盐水对照组。结果显示,rhIL-12剂量依赖性地提高健康人和CHB患者PBMCs产生的IFN-γ水平,且对CHB患者作用更强,不同分型的CHB患者IFN-γ水平基本无显著差异,各组IL-4均检测不到。这表明rhIL-12可增强不同临床分型的CHB患者Th1 (T Helper1 cell)细胞免疫功能,为rhIL-12作为免疫调节剂治疗CHB提供了依据。rhIL-12与rHBsAg联合应用的增强作用：制备9名健康人和15名CHB患者的外周血PBMCs,分别与rhIL-12 (0.01,0.1, 1.0ng/ml)、rHBsAg (0.5μg/ml)或rhIL-12 (0.01,0.1, 1.0ng/ml)联合rHBsAg (0.5μg/ml)孵育72 h。结果发现联合组诱生的IFN-γ明显高于单用rhIL-12或rHBsAg组,这提示rhIL-12联合rHBsAg有增加特异性细胞免疫应答作用。1.2体内药效学在BALB/c、C57BL/6J、HBV转基因小鼠和食蟹猴四种动物模型上进行。BALB/c小鼠皮下注射低、中、高剂量rmIL-12 (recombinant mouse interleukin-12,0.05,0.15,0.45μg/10g),并设生理盐水对照,3天给药1次,共2次。分别于给药前,给药后24h,给药后72h以及第2次给药后24h眼眶采血,检测血清IFN-γ的浓度。结果显示,rmIL-12第一次给药后小鼠血清中IFN-γ的浓度在24h达到高峰,且具有明显的剂量依赖性。72h时血清中的IFN-γ基本恢复到给药前水平。此时再给药1次,虽然仍有明显的量效关系,但给药后24h产生的IFN-γ浓度比第1次给药明显降低。本研究结果表明,rmIL-12在BALB/c小鼠体内能剂量依赖性诱生IFN-γ,增强细胞免疫作用,且rmIL-12诱生IFN-γ作用存在预处理效应。C57BL/6J小鼠皮下注射低、中、高剂量rmIL-12 (0.05,0.15,0.45μg/10g),并设生理盐水对照,3天给药1次,连续3次。给药前、第1次给药后24h和第3次给药后24h眼眶采血。结果显示,C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠血清中IFN-γ的分泌规律相似,即24小时达到高峰,rmIL-12低、中、高3剂量组与生理盐水组比较,IFN-γ含量剂量依赖性地显著升高(P均<0.001)。结果证明rmIL-12具有增强C57BL/6J小鼠细胞免疫的功能。HBV转基因小鼠腹腔注射低、中、高剂量rmIL-12(0.05,0.25,0.75μg/10g),并设生理盐水对照组,每周给药2次,共4周。给药前、第8次给药后检测血清HBV DNA。结果显示,rmIL-12第8次给药后,各剂量组DNA载量与NS组比较均无显著差异(P>0.05),但三个剂量组HBV DNA均较给药前下降,只有低剂量组有统计意义(P<0.05)。本实验初步表明rmIL-12具有降低HBV转基因小鼠血清HBV DNA载量作用。食蟹猴分别皮下注射0.5,5.0,40.0μg/kg rhIL-12及0.5,40.0μg/kg rhIL-12联合rHBsAg。rhIL-12每周给药3次,共40次。疫苗的给药剂量为20μg/kg,每4周给药一次,共给药4次。检测外周血IFN-γ、IL-2、IL-4、TNF-α含量、rhIL-12中和抗体及T细胞亚群分布。对照组及单用rHBsAg组各时间点IFN-γ含量均测不出。rhIL-12的三个剂量组及rHBsAg与rhIL-12联用组于首次给药后6h仅高剂量rhIL-12组IFN-γ含量可测,且显著高于对照组(P<0.001)；24h中高剂量rhIL-12组检测到IFN-γ且显著高于对照组(P<0.001)；至首次药后48h,与24h类似,IFN-γ进一步升高,rhIL-12高剂量联合组IFN-γ较单用组有升高趋势,但无统计意义。第二次药后24小时和第4次药后24小时,上述rhIL-12给药组所有动物均检测到IFN-γ,浓度达到峰值,与对照组比较均有非常显著意义(P<0.001),并且有一定的剂量关系。第7次和13次给药后24小时,仅部分检测到IFN-γ,并且浓度大幅下降,至第38次给药后24小时,几乎检测不到IFN-γ。40.0μg/kg rhIL-12与rHBsAg联用组在首次药后6、24、48h、IFN-γ产生量明显升高,和40.0μg/kg rhIL-12组比较,显示了一定的增强刺激作用。rhIL-12给药3周,rHBsAg疫苗给予4周后,所有动物均产生了抗IL-12的中和抗体。rhIL-12明显升高CD3及CD8细胞的百分率,明显降低CD4百分率及CD4/CD8比值。而单用rHBsAg对上述指标无明显影响,与rhIL-12联合显示了一定的增强作用。各实验组动物同时检测IL-2、IL-4、TNF-α水平,给药前后均无明显变化。提示rhIL-12可以诱生IFN-γ,而对IL-2、IL-4、TNF-α无影响,即Thl型细胞免疫反应占优势。2作用机制研究rhIL-12具有抗HBV作用是由于其能够诱生内源性IFN-γ,抑制HBV DNA复制。因此,我们探讨了IFN-γ的细胞来源及rhIL-12作用的信号转导途径。(1)8名健康人PBMCs分别与rhIL-12 (1ng/ml)、rHBsAg (0.5μg/ml)和lng/ml rhIL-12+0.5μg/ml rHBsAg体外孵育24h,采用流式细胞术检测CD4+IFN-γ+T细胞、CD8+IFN-γ+T细胞及CD56+IFN-γ+NK细胞百分比。结果显示,rhIL-12组CD8+IFN-γ+T细胞及CD56+IFN-γ+NK细胞百分比与对照组比较均有明显升高,且有统计学意义(P<0.05); rHBsAg组各细胞百分率升高不如rhIL-12组,与对照组比较无显著差异(P>0.05); rhIL-12与rHBsAg联合组CD8+IFN-γ+T细胞及CD56+IFN-γ+NK细胞百分比均较对照组明显升高,且有非常显著差异(P<0.01),其中CD56+IFN-γ+NK细胞与rHBsAg组比较均有显著差异(P<0.05)该结果提示rhIL-12诱生的IFN-γ主要来自CD56+ NK细胞、CD8+T细胞,其次是CD4+T细胞,rhIL-12与rHBsAg联合具有增强作用。(2)IL-12的生物学活性具有专一性,必须由高亲合力的IL-12R(interleukin-receptor)来介导。为进一步研究rhIL-12对IL-12R表达的影响,制备7名健康人PBMCs,分别与rhIL-12 (1ng/ml)、rHBsAg (0.5μg/ml)和1ng/ml IL-12+0.5μg/ml rHBsAg孵育72h,采用流式细胞术测定表达IL-12Rβ1、IL-12Rβ2的CD4+、CD8+、CD56+细胞数。结果表明：rhIL-12组表达p1和p2受体的各细胞亚群均有不同程度升高,且CD8+IL-12Rβ2和CD56+IL-12Rβ1上调幅度尤其明显,与对照组比较均有非常显著差异(P<0.01)。rHBsAg组受体阳性细胞增加幅度大于rhIL-12组,其中CD56+IL-12Rβ1升高较之有非常显著意义(P<0.01)。与对照组比较,CD4+IL-12Rβ1和CD8+IL-12Rβ1 P<0.05;-CD56+ IL-12Rβ1 P<0.001; CD4+IL-12Rβ2和CD56+IL-12Rβ2 P<0.05; CD8+IL-12Rβ2 P<0.01。rhIL-12与rHBsAg联合组表达IL-12Rβ1、IL-12Rβ2的CD4+、CD8+、CD56+细胞数增加,与对照组比较均有显著差异(P<0.01或P<0.001),但CD4+IL-12Rβ2除外。联合组增加幅度大多明显高于单用rhIL-12或rHBsAg组,其中CD8+IL-12Rβ1和CD56+IL-12Rβ1与单用rhIL-12或rHBsAg组比较均有显著差异(P<0.05和P<0.01)。这表明rhIL-12和rHBsAg单独均能上调健康人PBMCs表面IL-12R的表达,且rhIL-12联合rHBsAg有增强作用。3 rhIL-12在食蟹猴体内的药代动力学3.1125I-rhIL-12的分布及代谢动力学采用Na125I标记结合三氯醋酸(trichloroacetic acid, TCA)沉淀蛋白的方法,研究了rhIL-12在食蟹猴体内的分布、动力学、排泄及血浆蛋白结合等。125I-rhIL-12的放化纯度为95.6±1.9(%),平均比活度为197.72 Bq/ng,生物活性与未标记对照品效价无显著性差异,检测的定量下限LOQ (limit of quantitation)为0.02 ng-当量／g(ml)。酸沉淀方法学确证表明,本方法基本满足分布试验要求。食蟹猴皮下注射125I-rhIL-12后,TCA沉淀放射性AUC (area under curve)和总放射性AUC排序均为肠内容>血>肾脏>>肌肉>脑,这表明该药主要分布在肠、血及肾脏,药物不易透过血脑屏障。总放射性AUC排序尿、胆汁高于肠内容,与尿、胆汁中含有大量降解的水分子放射性有关。给药后血清TCA沉淀放射性和总放射性AUC(o-t)分别为158.77±16.00和216.07±28.18 ng-当量·h/ml; Cmax (maximum concentration)分别为6.62±0.57和7.91±0.39 ng-当量/ml, Tmax(peak time)均为5.33±1.15 h; MRT(mean resistance time)分别为21.82±1.21和22.96±2.02 h；CL(s) (clearance)分别为11.30±1.25和8.36±1.36 ml/kg/h; Vd(distribution volume)分别为0.35±0.02和0.26±0.01 L／kg；消除相半衰期分别为21.82±1.02和22.19±3.47 h。168 h尿、粪分别累计排出注入放射性量的84.4±6.0(%)和0.96±0.17(%),尿、粪合计排出注入放射性量的85.33±5.82(%)。这说明rhIL-12主要经尿排泄,少量经粪、胆汁中排出。尿中主要排泄代谢物,无原形,而胆汁中代谢物与原形并存。体外血浆蛋白结合试验表明,125I-rhIL-12无血浆蛋白结合现象。3.2 rhIL-12的药代动力学及药效动力学为研究rhIL-12在食蟹猴体内的PK (Pharmacokinetics)及PD(Pharmacodynamics),设rhIL-12低、中、高(0.15,0.30,1.50μg/kg)皮下注射组,rhIL-12(0.60μg/kg)静脉给药组及rhIL-12与合用rHBsAg组(0.30μg/kgrhIL-12 SC+20μg/kg rHBsAg IM),上述组动物单次给药。低剂量组兼做连续给药组,每4天给药一次,连续给药5次代谢动力学样品采集单次皮下给药组(低、中、高、合用rHBsAg组)：于给药前、药后2h、4h、6h、8h、10h、24h、48h、72h、120h及168h各取全血约1ml。静脉给药组：于给药前、药后1min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、24h、48h、72h、120h及168h各取全血约lml。连续给药组：于首次药前、药后2h、4h、6h、8h、10h、24h、48h、72h；第2、3、4次药前、药后8h；第5次药前、药后2h、4h、6h、8h、10h、24h、48h、72h、120h及168h各取全血约1ml。药效动力学样品采集连续给药组动物于给药前、首次药后8、24、48、72h,第2、3、4次药前、药后8、24、72h,及第5次药前、药后8、24、48、72h采集取全血约1ml。rhIL-12高剂量组动物于给药前、首次药后8、24、48、72h采集取全血约lml。用ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)方法测定血清中rhIL-12浓度,求算PK参数,方法的定量下限为0.05 ng/ml。同时采用ELISA方法检测连续给药组及高剂量组动物血清中IFN-γ的含量,研究rhIL-12药效动力学。低、中、高剂量组的AUC(0-t)分别为9.03±2.85、25.34±7.20和186.65±67.32h·ng/ml; AUC(0-∞)分别为10.52±3.26、26.43±8.25和190.66±70.55 h·ng/ml; Cmax分别为.0.50±0.14、0.95±0.33和8.14±3.21 ng/ml; Tmax分别为6.50±1.91、7.00±1.15和6.00±2.31 h; MRT分别为11.69±2.73、27.67±14.50和23.74±7.21 h；T1/2分别为10.04±4.82、22.91±15.52和19.75±10.06 h；CL分别为15.88±7.00、12.25±3.85和8.89±3.85 ml/h/kg; Vd分别为213.92±85.72、341.88±147.37和287.53±273.27 ml/kg;绝对生物利用度F分别为65.16%,54.57%,78.72%,平均为66.15±12.11(%)。低、中、高剂量组间的剂量比为1:2:10; Cmax之比为1：1.91：16.31；AUC(0-t)之比为1：2.81：20.68。该结果表明rhIL-12单次皮下注射的PK基本呈现线性动力学特征。合用rHBsAg组的动力学参数与等剂量的rhIL-12组相比,无统计差异,即rHBsAg对rhIL-12的代谢行为无影响。连续皮下注射给药5次后,因出现抗rhIL-12抗体,血清中的rhIL-12基本检测不到,无法计算rhIL-12连续给药后的动力学参数。连续给药组动物IFN-γ产生率较低,大部分时间点的样本无法检测到IFN-γ或数值低于最低可靠定量限(lowest limit of quantitation, LLOQ)。首次仅有1只动物血清可检测到IFN-γ，72h时浓度最高,较血清rhIL-12达峰时间(4-8h)推后。高剂量组动物血清全部能检测到IFN-γ, rhIL-12在体内的药效反应与给药剂量成正相关,其数值明显高于同期连续给药组(低剂量组)。血清中IFN-γ的达峰时间在24h～72h之间,较血清rhIL-12达峰时间(4-8h)推后。