一、 研究背景在美国,创伤是青年的头号死亡原因。尽管一些患者可以在创伤的早期幸存,但是他们往往需要面临另一个挑战,即肺部感染和急性呼吸窘迫综合症。(Acute respiratory disease syndrome,ARDS)。ARDS的发病机制涉及多个环节,既往研究在ARDS发生发展机制领域取得了一些进展,但其具体机制目前仍然没有完全阐明。ARDS的核心机制是全身炎症反应综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome,SIRS),各种致伤因子通过SIRS导致ARDS。在对以SIRS为核心的ARDS发生机制的研究中发现：感染和非感染的刺激可以分别通过病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)作用于模式识别受体(pattern recognition Receptors,PRRs),继而促进炎性细胞因子的表达和分泌,介导瀑布式炎症反应,最终导致ARDS的发生。过去的研究显示,创伤后呼吸机相关肺炎(ventilator-associated pneumonia,VAP)与高死亡率和ICU住院时间延长有关。虽然我们目前已发现严重的损伤和受损的免疫反应相关,但是对损伤引起的免疫抑制的原因及机制还知之甚少。DAMPs/PAMPs作用于PRRs在IL-1β的合成和释放中扮演重要角色。目前已发现的PRRs主要分为以下三类：Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)、 RIG-I样受体(retinoic acid-inducible gene-I [RIG-I]-like receptors,RLRs)和NOD样受体(nucleotide binging oligomerization domain[NOD]-like receptors, NLRs)。胞外刺激物主要是通过TLRs作用于细胞介导信号转导的。到目前为止,已发现了13种TLRs,它们中的大部分被深入研究并且发现它们各自的配体。像TLR-2介导识别包括脂蛋白、脂肽、脂磷壁酸等微生物成分。TLR-9主要被含有CpGDNA的细菌,一些双链DNA病毒和人工合成的CpG核苷酸刺激。巨噬细胞在诱导和调节肺部炎症时的免疫反应中起到重要作用。它能识别病原微生物并分泌TNF-a,IL-6 and IL-1β等促炎因子。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性杆菌细胞壁的重要组成部分,重要的PAMPs,可以作用于巨噬细胞,通过NF-kB介导炎症因子的合成和释放。LPS耐受,是指机体接受小剂量LPS刺激后,对LPS的再刺激表现出低反应的现象。这种现象常常在创伤后期免疫抑制继发脓毒血症的患者中发现。近年来,我们对LPS耐受机制和LPS再刺激诱导的巨噬细胞敏感性降低的认识不断提高,对LPS的信号通路也有了更为深刻的理解。广义的内毒不特指LPS的预刺激所诱发的对LPS的耐受。研究表明LPS是通过众多PRRs中的TLR4启动信号转导的。研究发现,不同微生物刺激通过不同的TLR介导。而且研究还发现,除了TLR4配体,其他TLRs的刺激物预处理巨噬细胞也可以产生对LPS的交互耐受。目前已经报道的有TLR-2, TLR-4, TLR-5,TLR-9,它们能诱导对同种刺激物再刺激的低反应。除此之外,还发现通过TLR-2和TLR4以及TLR-4和TLR-9的刺激物可以相互替代,诱导交互耐受的发生。线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)与核DNA(bDNA)起源和进化有很大差异。目前主流学说认为线粒体DNA来源于细菌DNA,它在体内与真核生物共生最终进化而成细胞器。与细菌DNA一样,mtDNA富含去甲基化的CpG序列,可以激活机体产生炎症反应。因此,mtDNA作为重要的DAMPs,其致炎机制也备受关注。目前的文献资料显示,CpG单核苷酸通过TLR9受体,介导丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)磷酸化上调NF-kB而进一步诱导炎症反应。在不同类型细胞中,CpG单核苷酸作用于相应的MAPKs并刺激不同的下游炎症因子或趋化因子的产生。MAPK级联激活是多种信号通路的中心,是接收膜受体转换与传递的信号并将其带入细胞核内的一类重要分子。在未受刺激的细胞内,MAPK处于静止状态。当细胞受到生长因子或其他因素刺激后,MAPK接到MAPK激酶激酶和MAPK激酶的活化信号后被激活,表现为逐级磷酸化。而且,p38MAPK还是LPS诱导的炎症反应中的重要因子。mtDNA预处理会对LPS刺激诱导的p38 MAPK有什么影响,目前还无相关研究结果说明。近年来,学者们发现创伤、休克等释放的内源性mtDNA可以作为重要的DAMPs通过TLR9作用于巨噬细胞。新近有研究发现,肺部损伤可以引起中性粒细胞向肺部转移,而向腹腔内注射mtDAMPs可以刺激腹部创伤,同时诱发中性粒细胞聚集。但是此时肺部中性粒细胞转向腹部移动,腹腔内注射mtDAMPs并没有和中性粒细胞协同刺激肺部炎症,反而使得肺部中性粒细胞移除肺组织。当从损伤、死亡或坏死组织释放时,中性粒细胞向肺部感染趋化的正常反应会减弱,提示肺部的趋化因子可能下降。这使得肺的免疫防御能力下降,更容易受到病原体损害。这种新机制的发现可能可以解释系统组织创伤、肺炎和脓毒血症的关系。这种线粒体DAMPs预处理抑制继发于肺挫伤的肺部炎症反应的发现提示mtDNA可能通过某种机制诱导免疫抑制。二、研究目的目前mtDNA对LPS的交互耐受作用尚不明确,本研究通过体内和体外实验探索mtDNA对LPS诱导的肺部炎症反应的抑制作用,阐明mtDNA预处理对LPS的耐受作用,对mtDNA在炎症反应中的作用进行深入探索,以期辅助炎性疾病的诊治。三、研究方法1、外源性mtDNA的获得：培养THP-1细胞,收集并提取THP-1细胞的mtDNA;取小鼠肝脏,充分研磨提取鼠mtDNA。并用分光光度计检测其浓度,并用荧光实时定量PCR(real-timePCR, RT-PCR)检测核基因GAPDH(人),18S(鼠),排除可能混杂核基因感染的干扰。2、刺激分化的THP-1细胞并检测：先用PMA处理细胞24h,诱导细胞分化。用不同浓度的ntDNA(0.1ug/ml,1 ug/ml, 5 ug/ml,10 ug/ml,20 ug/ml)或1640培养基预处理分化的THP-1细胞2h或24h,后给予LPS (100ng/ml)刺激3h。通过ELISA试剂盒检测细胞培养上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)的变化。用最适ntDNA浓度刺激THP-1预处理细胞,再给予LPS(100ng/ml)刺激。通过RT-PCR检测细胞中炎症因子的mRNA表达情况。3. mtDNA刺激对LPS介导的p38 MAPK激活的影响：借助Westren Blot方法检测mtDNA预处理和LPS再刺激前后,p38 MAPK的蛋白水平及磷酸化的差异。4、mtDNA预处理对LPS诱导的C57BL/6小鼠肺部炎症的影响：将36只小鼠随机分四组分别给予生理盐水、LPS、mtDNA、mtDNA+LPS刺激,mtDNA腹腔注射刺激,通过气管内给药的方式给予小鼠LPS(100ug/kg)刺激。LPS处理3h后处死小鼠,取肺组织。通过HE染色和免疫荧光观察各组的肺组织病理变化,对比炎症反应轻重；测量肺湿干比。将肺组织研磨均匀,蛋白酶溶解并收集组织上清,用ELISA试剂盒检测各组的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的蛋白水平。统计分析各组结果。四、实验结果1、mtDNA预处理诱导巨噬细胞对LPS的耐受：分化的THP-1细胞在不同浓度的mtDNA预处理24h,再受到LPS刺激后,释放的炎症因子TNF-a (5ug/ml mtDNA)、IL-1β(5ug/ml mtDNA)、IL-6(lOug/ml mtDNA)水平都下降了,而IL-8的蛋白水平变化无统计学差异。该结果表明mtDNA预处理可以抑制LPS诱导的炎症因子释放。而不同浓度mtDNA预处理2h后给予LPS再刺激,各细胞因子的释放增加,此时mtDNA和LPS表现出协同效应。RT-PCR结果显示,mtDNA 10ug/ml预处理THP-1细胞24h后,再给予LPS刺激可使LPS诱导的炎症因子(TNF-a,IL-1β and IL-6)基因表达水平下降,而IL-8的基因水平无明显变化。这个结果和细胞培养上清蛋白释放结果一致。2.P38 MAPK在mtDNA诱导的LPS耐受中的作用：我们既往的研究结果发现,mtDNA可以激活中性粒细胞的TLR9-p38 MAPK通路诱导无菌炎症和ALI。而且P38 MAPK已被证实是LPS诱导的炎症反应中的重要因子。我们通过Western Blot技术检测小鼠肺组织的p38蛋白水平发现,单独给予mtDNA或LPS刺激都可以显著诱导P38 MAPK上调和磷酸化,而对比未添加预处理的THP-1细胞,给予LPS刺激诱导的p38磷酸化在mtDNA预处理组显著被抑制了。3、mtDNA预处理抑制LPS诱导的小鼠肺部炎症：通过观察4组小鼠的肺组织病理发现,LPS组的小鼠肺部炎症最重,mtDNA+LPS组小鼠的肺部炎症较LPS组减轻,提示mtDNA预处理对LPS诱导的肺部炎症有抑制作用。通过比较各组小鼠肺的湿干比发现,LPS处理组肺湿干比最大,而组mtDNA+LPS组有所减小。此外,我们还对肺组织研磨上清进行ELISA检测,结果发现,mtDNA预处理可以显著降低LPS诱导的TNF-a和IL-6释放,但IL-1p和IL-8的释放无明显改变。五、结论：我们的研究表明mtDNA预处理THP-1细胞可以抑制LPS诱导的炎症因子表达和释放,导致细胞的LPS耐受效应的产生。而且,我们的结果还提示p38MAPK在mtDNA和LPS的交互耐受中有重要的作用。内毒素耐受既可以降低过度炎症反应,减少机体损伤；又可能导致免疫抑制,增加二次感染的风险。内毒素耐受及其与刺激物之间的量化关系,对诊治炎症相关疾病有重要的作用。我们将在未来的研究中进行更为广泛和深入的探索