论文部分内容阅读
基于生物信息学手段对A.caldus MTH-04基因组进行分析，并通过无痕敲除等技术研究SDO在A.caldus中的功能及调控机制，对深入了解A.caldus的硫代谢机制及其调控网络具有重要意义。
本论文的工作主要从以下几个方面展开:
第一，A.caldus硫双加氧酶的鉴定分析。
首先，以基因A5904_0790作为出发点，寻找A.caldus MTH-04基因组中可能编码硫双加氧酶的基因。通过同源比对在A.caldus MTH-04基因组中发现了两个编码A5904_0790同源蛋白的基因A5904_0421和A5904_1112。通过结构域比对及金属结合位点分析等方法对这两个编码蛋白进行功能预测，推测A5904_0421编码蛋白可能具有SDO类似的功能，而A5904_1112编码蛋白缺失金属结合位点关键氨基酸残基，可能不具有SDO类似的功能。之后成功在Escherichia coliBL21(DE3)中对基因A5904_0421、A5904_0790和A5904_1112进行了异源表达。对纯化的重组蛋白进行体外酶活检测发现，A5904_0421和A5904_0790编码蛋白具有硫双加氧酶活性，而A5904_1112编码蛋白不具有硫双加氧酶活性，与功能预测结果相一致，确定A.caldus MTH-04中SDO的编码基因为A5904_0421（命名为sdo1）和A5904_0790（命名为sdo2）。
进一步对纯化的SDO重组蛋白进行酶学性质研究。结果显示:A59040421重组蛋白(SDO1)的最适作用温度是45℃左右，最适pH值为pH8.0，与已报道的A59040790重组蛋白(SDO2)最适反应条件研究结果一致;抑制剂对SDO1酶活的影响也与在SDO2中的研究结果基本一致，即常见二价金属离子（除Mg2+外）以及EDTA和巯基修饰剂NEM均强烈抑制SDO1的酶活，而二硫键还原剂DTT则对SDO1的酶活表现出中等程度的抑制;以GSSH为底物，分别对SDO1和SDO2进行酶的动力学分析发现，二者的Km值没有显著差异，但SDO1的kcat明显小于SDO2的kcat，kcat/Km比值显示SDO2具有更高的催化效率;通过ICP-MS对SDO蛋白结合的金属含量进行分析，发现SDO蛋白主要与Fe、Mn结合，且SDO1比SDO2结合更多的Fe;结合序列比对分析可知，二者酶活差异可能是由于SDO1缺失GSH结合位点保守氨基酸残基造成的。
利用A.caldus中的硫双加氧酶作为查询序列对NCBI上已测序的基因组进行同源比对分析发现，SDO1的同源蛋白主要集中于化能自养细菌中，而SDO2的同源蛋白在动植物及异养细菌中均有发现。系统发育分析显示SDO2属于SDO中的ETHE1亚类，而SDO1及其同源蛋白与已知的三个SDO亚类(ETHE1、SdoA、B1h)进化关系均较远，因此将其归为一个新的亚类，命名为SdoS。对嗜酸硫杆菌属菌株进行分析发现，sdo基因在各菌株基因组中均以多拷贝形式存在，且编码ETHE1及SdoS亚类SDO的基因通常同时存在。序列比对分析显示SdoS亚类SDO与其他三个亚类SDO的GSH结合位点保守氨基酸残基有所区别，与此前在SDO结构研究中报道的GSH结合区可以作为区分这些亚类蛋白的依据这一结果相一致。新亚类SDO的发现为进一步研究不同亚类SDO间作用机制的异同奠定了基础。
第二，硫双加氧酶在A.caldus硫代谢系统中的功能研究。
为了研究SDO在A.caldus硫代谢系统中发挥的具体功能，基于同源重组原理，对A.caldus中的sdo和sdo2基因进行了无痕敲除，成功构建了基于A.caldusMTH-04的基因单敲除株Δsdo1、Δsdo2以及基于Δsdo1的基因双敲除株Δsdo1&2。与此同时，成功构建了基于A.caldus MTH-04的sdo过表达菌株OE-sdo1、OE-sdo2以及基于sdo基因敲除株的sdo回补菌株Δsdo1/sdo1、Δsdo2/sdo2。这一系列突变株的成功构建为研究sdo在A.caldus中的功能奠定了基础。
在不同能源培养条件下，从生长曲线、底物消耗、代谢终产物检测和硫代谢相关基因转录水平变化等方面针对本文构建的sdo系列突变株进行了系统研究。
在生长曲线方面，以硫粉为能源培养时，敲除株生长稍弱于野生型;以连四硫酸盐为能源培养时，Δsdo1及Δsdo1&2无法生长，Δsdo2比野生型更早进入对数生长期，回补sdo1基因后Δsdo1恢复了利用连四硫酸盐为能源生长的能力;以硫代硫酸盐为能源培养时，Δsdo1及Δsdo1&2比野生型进入对数生长期稍晚，而Δsdo2仍比野生型更早进入对数生长期。sdo过表达菌株在以硫粉、连四硫酸盐和硫代硫酸盐为能源培养时均未对生长曲线造成明显影响。
高效液相色谱检测连四硫酸盐的消耗时发现，生长进入稳定期后，Δsdo2和野生型培养基中的连四硫酸盐均耗尽，而Δsdo1及Δsdo1&2培养基中的连四硫酸盐未见消耗，与生长曲线的结果一致。
利用高效液相色谱及离子色谱检测了代谢终产物，发现各菌株在不同能源培养条件下的代谢终产物均为硫酸根，但产量不同:硫粉培养条件下，敲除株比野生型产生更多硫酸根;连四硫酸盐培养条件下，Δsdo2和野生型产生等量硫酸根，而Δsdo1及Δsdo1&2由于无法生长，没有硫酸根生成;硫代硫酸盐培养条件下，各菌株生成的硫酸根产量没有显著差异。
以GSH为辅因子测定了各菌株以硫粉为能源培养条件下的硫氧化能力，发现与野生型相比，敲除sdo1会显著提高硫氧化活性，而敲除sdo2对氧化能力影响不大。
通过RT-qPCR分别分析了不同能源培养条件下野生型中不同生长时期中sdo1、sdo2的转录变化以及敲除株Δsdo1、Δsdo2、Δsdo1&2、过表达菌株OE-sdo1、OE-sdo2中硫代谢基因转录变化，结果发现:sdo1、sdo2在对数中后期转录水平较高，且sdo1在硫粉培养时转录水平明显高于连四硫酸盐培养时;敲除或过表达sdo基因均会引起其他硫代谢基因转录水平变化，例如tetH、tqo及部分sox-Ⅱ基因在不同能源培养时均在sdo敲除株中上调，在sdo过表达菌株中下调。
以上结果表明，SDO在A.caldus硫代谢过程中主要代谢胞质内代谢过程中形成的单质硫，而非此前推测的代谢活化后的胞外单质硫;SDO不能代替缺失的Sox(CD)2亚基发挥作用;SDO1与SDO2在A.caldus代谢过程发挥不同作用，不能完全相互替代:sdo1与S4I途径关系密切，是A.caldus以连四硫酸盐为能源生长过程中的必需基因，而sdo2与sqr-sdo-rhd途径关系密切，除硫代谢外在胞内硫化物解毒方面可能也发挥重要作用。
第三，硫双加氧酶的调控机制初探。
通过生物信息学分析发现，A.caldus中sdo2基因上游存在可能编码CRP家族转录调控因子的基因A5904_0789，推测其可能参与sdo基因相关的转录调控。之后成功在Escherichia coli BL21(DE3)中对基因A5904_0789进行了异源表达。利用纯化的A5904_0789重组蛋白对sdo基因启动子进行凝胶阻滞分析(EMSA)，结果发现A5904_0789编码的CRP家族转录调控因子可以结合sdo2（即A5904_0790）的启动子区，而与sdo1（即A5904_0421）的启动子区无结合作用。成功构建针对A5904_0789的无痕敲除菌株Δcrp，并对其在不同能源培养条件下的生长特性进行了研究，发现其生长特性与Δsdo2相似。以上结果表明，A5904_0789编码的CRP家族转录调控因子可能参与sdo2相关转录调控，而sdo1相关转录机制有待进一步研究。
本文在A.caldus MTH-04基因组中新发现了硫双加氧酶编码基因A5904_0421，并对其与A5904_0790编码蛋白的酶学性质进行了研究;基于系统发育分析对A.caldus硫双加氧酶与已知硫双加氧酶的进化关系进行分析，发现了硫双加氧酶的新亚类SdoS;构建了sdo基因突变株并分析了其生长特性、底物消耗、产物生成及其对其他硫代谢相关基因转录水平影响等，阐明了SDO在A.caldus硫代谢系统中的功能:SDO在A.caldus硫代谢过程中主要代谢胞质内代谢过程中形成的单质硫，sdo1是A.caldus以连四硫酸盐为能源生长过程中的必需基因，而sdo2除硫代谢外在胞内硫化物解毒方面可能也发挥重要作用;发现了A5904_0789编码的CRP家族转录调控因子可能参与sdo2相关转录调控。对SDO的鉴定分析及其在A.caldus硫代谢系统中的功能及其调控机制的研究对深入了解A.caldus的硫代谢及其调控网络具有重要意义，为进一步完善A.caldus硫代谢系统模型提供了有力的依据，并对A.caldus的工业应用具有积极指导意义。
本论文的工作主要从以下几个方面展开:
第一，A.caldus硫双加氧酶的鉴定分析。
首先，以基因A5904_0790作为出发点，寻找A.caldus MTH-04基因组中可能编码硫双加氧酶的基因。通过同源比对在A.caldus MTH-04基因组中发现了两个编码A5904_0790同源蛋白的基因A5904_0421和A5904_1112。通过结构域比对及金属结合位点分析等方法对这两个编码蛋白进行功能预测，推测A5904_0421编码蛋白可能具有SDO类似的功能，而A5904_1112编码蛋白缺失金属结合位点关键氨基酸残基，可能不具有SDO类似的功能。之后成功在Escherichia coliBL21(DE3)中对基因A5904_0421、A5904_0790和A5904_1112进行了异源表达。对纯化的重组蛋白进行体外酶活检测发现，A5904_0421和A5904_0790编码蛋白具有硫双加氧酶活性，而A5904_1112编码蛋白不具有硫双加氧酶活性，与功能预测结果相一致，确定A.caldus MTH-04中SDO的编码基因为A5904_0421（命名为sdo1）和A5904_0790（命名为sdo2）。
进一步对纯化的SDO重组蛋白进行酶学性质研究。结果显示:A59040421重组蛋白(SDO1)的最适作用温度是45℃左右，最适pH值为pH8.0，与已报道的A59040790重组蛋白(SDO2)最适反应条件研究结果一致;抑制剂对SDO1酶活的影响也与在SDO2中的研究结果基本一致，即常见二价金属离子（除Mg2+外）以及EDTA和巯基修饰剂NEM均强烈抑制SDO1的酶活，而二硫键还原剂DTT则对SDO1的酶活表现出中等程度的抑制;以GSSH为底物，分别对SDO1和SDO2进行酶的动力学分析发现，二者的Km值没有显著差异，但SDO1的kcat明显小于SDO2的kcat，kcat/Km比值显示SDO2具有更高的催化效率;通过ICP-MS对SDO蛋白结合的金属含量进行分析，发现SDO蛋白主要与Fe、Mn结合，且SDO1比SDO2结合更多的Fe;结合序列比对分析可知，二者酶活差异可能是由于SDO1缺失GSH结合位点保守氨基酸残基造成的。
利用A.caldus中的硫双加氧酶作为查询序列对NCBI上已测序的基因组进行同源比对分析发现，SDO1的同源蛋白主要集中于化能自养细菌中，而SDO2的同源蛋白在动植物及异养细菌中均有发现。系统发育分析显示SDO2属于SDO中的ETHE1亚类，而SDO1及其同源蛋白与已知的三个SDO亚类(ETHE1、SdoA、B1h)进化关系均较远，因此将其归为一个新的亚类，命名为SdoS。对嗜酸硫杆菌属菌株进行分析发现，sdo基因在各菌株基因组中均以多拷贝形式存在，且编码ETHE1及SdoS亚类SDO的基因通常同时存在。序列比对分析显示SdoS亚类SDO与其他三个亚类SDO的GSH结合位点保守氨基酸残基有所区别，与此前在SDO结构研究中报道的GSH结合区可以作为区分这些亚类蛋白的依据这一结果相一致。新亚类SDO的发现为进一步研究不同亚类SDO间作用机制的异同奠定了基础。
第二，硫双加氧酶在A.caldus硫代谢系统中的功能研究。
为了研究SDO在A.caldus硫代谢系统中发挥的具体功能，基于同源重组原理，对A.caldus中的sdo和sdo2基因进行了无痕敲除，成功构建了基于A.caldusMTH-04的基因单敲除株Δsdo1、Δsdo2以及基于Δsdo1的基因双敲除株Δsdo1&2。与此同时，成功构建了基于A.caldus MTH-04的sdo过表达菌株OE-sdo1、OE-sdo2以及基于sdo基因敲除株的sdo回补菌株Δsdo1/sdo1、Δsdo2/sdo2。这一系列突变株的成功构建为研究sdo在A.caldus中的功能奠定了基础。
在不同能源培养条件下，从生长曲线、底物消耗、代谢终产物检测和硫代谢相关基因转录水平变化等方面针对本文构建的sdo系列突变株进行了系统研究。
在生长曲线方面，以硫粉为能源培养时，敲除株生长稍弱于野生型;以连四硫酸盐为能源培养时，Δsdo1及Δsdo1&2无法生长，Δsdo2比野生型更早进入对数生长期，回补sdo1基因后Δsdo1恢复了利用连四硫酸盐为能源生长的能力;以硫代硫酸盐为能源培养时，Δsdo1及Δsdo1&2比野生型进入对数生长期稍晚，而Δsdo2仍比野生型更早进入对数生长期。sdo过表达菌株在以硫粉、连四硫酸盐和硫代硫酸盐为能源培养时均未对生长曲线造成明显影响。
高效液相色谱检测连四硫酸盐的消耗时发现，生长进入稳定期后，Δsdo2和野生型培养基中的连四硫酸盐均耗尽，而Δsdo1及Δsdo1&2培养基中的连四硫酸盐未见消耗，与生长曲线的结果一致。
利用高效液相色谱及离子色谱检测了代谢终产物，发现各菌株在不同能源培养条件下的代谢终产物均为硫酸根，但产量不同:硫粉培养条件下，敲除株比野生型产生更多硫酸根;连四硫酸盐培养条件下，Δsdo2和野生型产生等量硫酸根，而Δsdo1及Δsdo1&2由于无法生长，没有硫酸根生成;硫代硫酸盐培养条件下，各菌株生成的硫酸根产量没有显著差异。
以GSH为辅因子测定了各菌株以硫粉为能源培养条件下的硫氧化能力，发现与野生型相比，敲除sdo1会显著提高硫氧化活性，而敲除sdo2对氧化能力影响不大。
通过RT-qPCR分别分析了不同能源培养条件下野生型中不同生长时期中sdo1、sdo2的转录变化以及敲除株Δsdo1、Δsdo2、Δsdo1&2、过表达菌株OE-sdo1、OE-sdo2中硫代谢基因转录变化，结果发现:sdo1、sdo2在对数中后期转录水平较高，且sdo1在硫粉培养时转录水平明显高于连四硫酸盐培养时;敲除或过表达sdo基因均会引起其他硫代谢基因转录水平变化，例如tetH、tqo及部分sox-Ⅱ基因在不同能源培养时均在sdo敲除株中上调，在sdo过表达菌株中下调。
以上结果表明，SDO在A.caldus硫代谢过程中主要代谢胞质内代谢过程中形成的单质硫，而非此前推测的代谢活化后的胞外单质硫;SDO不能代替缺失的Sox(CD)2亚基发挥作用;SDO1与SDO2在A.caldus代谢过程发挥不同作用，不能完全相互替代:sdo1与S4I途径关系密切，是A.caldus以连四硫酸盐为能源生长过程中的必需基因，而sdo2与sqr-sdo-rhd途径关系密切，除硫代谢外在胞内硫化物解毒方面可能也发挥重要作用。
第三，硫双加氧酶的调控机制初探。
通过生物信息学分析发现，A.caldus中sdo2基因上游存在可能编码CRP家族转录调控因子的基因A5904_0789，推测其可能参与sdo基因相关的转录调控。之后成功在Escherichia coli BL21(DE3)中对基因A5904_0789进行了异源表达。利用纯化的A5904_0789重组蛋白对sdo基因启动子进行凝胶阻滞分析(EMSA)，结果发现A5904_0789编码的CRP家族转录调控因子可以结合sdo2（即A5904_0790）的启动子区，而与sdo1（即A5904_0421）的启动子区无结合作用。成功构建针对A5904_0789的无痕敲除菌株Δcrp，并对其在不同能源培养条件下的生长特性进行了研究，发现其生长特性与Δsdo2相似。以上结果表明，A5904_0789编码的CRP家族转录调控因子可能参与sdo2相关转录调控，而sdo1相关转录机制有待进一步研究。
本文在A.caldus MTH-04基因组中新发现了硫双加氧酶编码基因A5904_0421，并对其与A5904_0790编码蛋白的酶学性质进行了研究;基于系统发育分析对A.caldus硫双加氧酶与已知硫双加氧酶的进化关系进行分析，发现了硫双加氧酶的新亚类SdoS;构建了sdo基因突变株并分析了其生长特性、底物消耗、产物生成及其对其他硫代谢相关基因转录水平影响等，阐明了SDO在A.caldus硫代谢系统中的功能:SDO在A.caldus硫代谢过程中主要代谢胞质内代谢过程中形成的单质硫，sdo1是A.caldus以连四硫酸盐为能源生长过程中的必需基因，而sdo2除硫代谢外在胞内硫化物解毒方面可能也发挥重要作用;发现了A5904_0789编码的CRP家族转录调控因子可能参与sdo2相关转录调控。对SDO的鉴定分析及其在A.caldus硫代谢系统中的功能及其调控机制的研究对深入了解A.caldus的硫代谢及其调控网络具有重要意义，为进一步完善A.caldus硫代谢系统模型提供了有力的依据，并对A.caldus的工业应用具有积极指导意义。