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构建具有最优功能的合成代谢途径是代谢工程及合成生物学面临的一个主要挑战。本文首先建立了多元质粒工程(Multiplex Iterative Plasmid Engineering,MIPE)技术,可以高效的对构建在质粒上的代谢途径进行组合优化。MIPE技术利用多元ssDNA重组向质粒中引入突变点,对质粒上的多个靶向位点进行组合修饰,通过一个反应能够构建107的质粒文库。同时,利用质粒DNA和ssDNA共转策略及限制性酶切介导的共筛选(Restriction Digestion mediated Co-Selection,RD CoS)策略提高了质粒ssDNA重组的效率进而提高了MIPE引入组合突变的能力。作为对MIPE的测试,我们首先利用MIPE优化含有5个基因的核黄素代谢途径,在一周时间内将核黄素产量提高了2.67倍。之后,我们利用MIPE同时靶向750 bp的红色荧光蛋白的23个密码子,在文库中实现了31%的密码子的平均突变率。之后,我们基于CRISPR-Cas9在大肠杆菌中建立一个快速、高效、可循环的基因组编辑系统,从而为在基因组上快速、便捷的优化代谢途径提供了一个有价值的工具。这项技术能够以接近100%的编辑效率进行基因敲除和插入等多种遗传操作,并且能够同时插入三个突变点。我们还建立了基于CRISPR-Cas9的可诱导的质粒消除系统,能够将gRNA质粒从细胞中消除,从而实现循环的基因组编辑,每个循环仅需两天。同时,我们发现使用有功能性的错配修复系统(mismatch repair,MMR)的野生菌株可以显著的降低细胞逃脱CRISPR切割的概率,进而提高基因组编辑效率。为了测试这项技术在代谢工程中的应用潜力,我们利用它将β-胡萝卜素合成代谢途径整合到了大肠杆菌基因组上,并且对甲基赤藓糖醇4-磷酸(methylerythritol 4-phosphate,MEP)代谢途径和中心碳代谢途径进行组合优化提高β-胡萝卜素产量。我们一共测试了33个基因组操作,构建了超过100个不同的菌株,其中最优菌株含有15个基因组修饰,通过分批发酵可以生产2.0 g/L的β-胡萝卜素。