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食物过敏是一种严重影响机体健康的Ⅰ型超敏反应,因摄食复杂食物致食物过敏问题时有发生,受到较多关注。家蚕蛹是蚕桑产业的重要副产物资源,在我国具有悠久的食用历史,由食用家蚕蛹引起的人和动物过敏问题给食用人群和养殖动物带来健康风险,制约了家蚕蛹在食用和饲用上的发展。其中来源于糖苷水解酶家族的变应原在食物过敏发病过程中起着重要作用,本文即以获得家蚕蛹致食物过敏的糖苷水解酶变应原为研究目的,研究了家蚕蛹几丁质酶结构与其致敏作用机理,为进一步明确家蚕蛹变应原的致敏机制及为食用家蚕蛹致敏的防治提供一定的科学依据。1、采用96只健康的5-6周龄雌性Balb/c小鼠进行家蚕蛹致敏模型构建,分别以皮下注射(含0.2mg粗蛋白和1mg铝佐剂)和口服灌胃(0.5mg粗蛋白)处理模型小鼠,结果表明两种方法均可致小鼠食物过敏,出现Ⅰ型超敏反应的典型特征,其肠绒毛结构均有较大程度受损,部分发生破损、断裂和脱落,残存的肠绒毛排列松散、紊乱,说明过敏炎症反应导致了小鼠空肠结构和功能的破坏。同时,致敏组小鼠足部出现明显的过敏肿胀。此外,利用Western blot免疫印迹反应可知与对照相比,致敏小鼠血清中出现了与家蚕蛹粗蛋白能特异性结合的抗体。2、采用蛋白质双向电泳和Western blot免疫印迹反应确定了与鼠源致敏血清特异性结合的家蚕蛹蛋白质斑点,经过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MOLDI-TOF/MS/MS)检测,分别确定了与鼠源致敏血清和人源致敏血清特异性结合的15个变应原蛋白(分别属于11种不同的蛋白质:家蚕C型凝集素-10、家蚕巨噬细胞甘露糖受体1、膜联蛋白9的C型异构体、14-3-3蛋白ζ亚型、膜联蛋白9的A型异构体、保幼激素结合蛋白、乙醇脱氢酶样X1型异构体、醛糖还原酶样X1型异构体、伴侣因子、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶2以及几丁质酶)和7个变应原蛋白(分别属于2种不同的蛋白质:家蚕蛹几丁质酶和家蚕蛹副肌球蛋白)。而属于糖苷水解酶家族的家蚕蛹几丁质酶(BmChi)均能对小鼠和人产生致敏性,故选择BmChi开展进一步研究。3、对BmChi蛋白与其它来源的几丁质酶和几丁质酶变应原进行生物信息学比对,结果发现其与美洲屋尘螨变应原Der f 18有序列相似性。此外,多种序列分析软件对BmChi蛋白的二级结构组成、亲疏水性、可塑性、抗原性以及表面可及性等进行了分析,预测的最优抗原表位位点为:23-37,66-74,70-82,107-120,139-153,192-201,228-236,270-279,308-327,402-415,497-510,537-555。针对预测表位位点分散的情况,采用重叠肽法设计合成了BmChi的全蛋白重叠15肽,并利用重组BmChi蛋白免疫小鼠制备的抗体血清进行筛选验证实验,其中氨基酸残基序号为536-550和116-130的肽段表现出较高反应活性,分别对两条小肽采用氨基酸顺序替代法和氨基酸残基消减法进行肽段编辑,通过实验确定最优结合抗原表位的氨基酸残基为:IDADN GDILN AMN。而同时P24和P108肽段中的氨基酸残基也存在着抗原表位。4、采用基于同源模建、刚性对接、常规动力学模拟以及分子拉伸动力学模拟解离等分子模拟手段对BmChi与小鼠IgE-Fv抗体片段特异性结合的性质进行了研究。同源模建技术获得了Bm Chi的最优3D构象及结合口袋位置,再以构建的BmChi结构为基础开展分子对接方法预测小鼠IgE-Fv与BmChi的结合模型,通过ZDock基于形状互补的得分、ZRank基于静电、范德华力、去溶剂化能等三种能量值的构象得分和RDock基于CHARMm力场的构象能量优化得分,评价了BmChi与小鼠IgE-Fv结合的稳定性,结果表明BmChi高活性小肽片段与小鼠IgE-Fv发生了强烈的氢键作用,在对BmChi与小鼠IgE-Fv的稳定结合中起到关键的作用,且两者复合物良好的静电表面分布对结合有较好的促进作用,从而使两者得到稳定结合。最后,通过对BmChi与小鼠IgE-Fv复合物的分子动力学模拟和拉伸分子动力学模拟来考察复合物的结合稳定性和动力学行为,结果表明,BmChi与小鼠IgE-Fv复合物在动力学模拟过程中结合能波动不大,表现出良好稳定性。随着模拟时间的推移,复合物回转半径、二级结构组成、溶剂可及性表面积和质心距离保持平衡,进一步说明了蛋白复合物结合的紧密。拉伸分子动力学模拟结果表明,BmChi与小鼠IgE-Fv的解离难度较大,从而说明了两者复合物的高稳定性。结合以上实验结果,我们推测小鼠IgE-Fv对BmChi表现出的高活性是由于小鼠IgE-Fv抗体与BmChi抗原表位的稳定结合所导致。