衰老是一个多因素参与的、涉及全身所有器官的病理生理过程。从细胞角度而言,衰老学说包括氧化应激学说、线粒体损伤学说、端粒酶学说等;从病因学角度而言,衰老主要是由内分泌紊乱、外界环境影响、基因表达调控失衡等引起。目前,衰老的基因表达调控研究成为探索衰老发病原因和预防衰老症状的重要方向,它主要从基因的启动子活性、转录调控水平、甲基化修饰以及单核苷酸多态性等方面分析衰老及衰老性疾病的发生机制。klotho基因是新近发现的抗衰老基因,该基因突变的小鼠可以表现出与人类衰老相似的症状,如动脉硬化、异位钙化、肺气肿、活动力减退、性腺发育不良、皮肤萎缩、低血糖以及严重的高磷酸盐血症等,而klotho基因过表达的小鼠可以延缓衰老症状。根据目前的研究成果,klotho基因发挥抗衰老作用的机制主要表现为:⑴抑制胰岛素/胰岛素样生长因子信号通路,该通路是进化上高度保守的抗衰老机制之一;⑵作为纤维母细胞生长因子（FGF23）的辅助因子,增加FGF23和FGF受体的亲和力,调节磷酸盐代谢。而且实验证实,血清高磷酸盐水平和衰老密切相关;⑶增加机体对氧化应激的抗性。另外,klotho蛋白还可以抑制其他生长因子信号通路、调节免疫功能、促进脂肪细胞的分化等,发挥抗衰老作用。大量的临床研究发现,klotho基因的单核苷酸多态性与衰老性疾病的易感性以及寿命密切关系。我们的前期工作也发现klotho基因G-395A位点的多态性与老年人动脉硬化的发病密切相关,并且此位点极有可能是老年人发生高血压病的基因靶点。klotho通过多种途径发挥抗衰老作用,意义重大。但是klotho基因的表达调控机制仍然不是十分清楚,而我们研究的重点是该基因的表达调控。随着基因组计划的完成,我们对大部分基因的结构和功能有了深入的认识,但是有些基因的转录调控机制目前仍不清楚,klotho基因便是其中之一。该基因定位于染色体13q12,基因全长约50kb,含有4个内含子和5个外显子,启动子区域内没有典型的TATA盒和CAAT盒,而是存在5个SP1结合位点。多组织Northern blot显示klotho基因在不同的组织中表达有差异,以肾脏中表达量最高。klotho基因的表达受许多因素的影响,研究表明,原发性高血压大鼠、醋酸去氧皮甾酮盐高血压大鼠、5/6肾切除大鼠、非胰岛素依赖性糖尿病大鼠等模型的肾组织中,klotho基因的表达水平显著下降;老年性肾损伤的大鼠中,肾脏组织klotho基因的表达量也明显下降。这些模型的共同特征是都存在氧化应激,而且应用抗氧化剂可以上调klotho基因的表达,推测氧化应激可能下调klotho基因的表达。另外,在klotho基因的启动子区域存在过氧化物酶体增殖激活受体γ（PPAR-γ）的反应原件,实验证实PPAR-γ兴奋剂可以上调klotho基因的表达。然而,klotho基因表达调控的影响因素、转录因子及反应原件、启动子活性变化机制仍然不是十分清楚,有待于进一步研究。研究发现,klotho基因过表达可以改善糖尿病肾病大鼠模型的肾功能,减少高糖诱导的氧化应激损伤和活性氧（ROS）的生成,那么氧化应激对klotho基因的表达调控有怎样的影响呢?衰老的氧化应激学说认为,细胞衰老和组织老化与机体ROS含量增加密切相关。研究表明,ROS加速细胞衰老与其激活蛋白激酶B（Akt/PKB）信号通路、胞外信号调节激酶（ERK）信号通路有关,这些通路通过改变衰老基因的表达调控,参与细胞衰老过程。目前认为,ROS作为信号调节因子,可以调节衰老基因如p66shc、Sirtuin、FOX03、klotho等的表达调控。这似乎暗示了氧化应激和klotho基因表达调控之间的联系。目前的实验主要从动物实验水平、组织化学水平分析ROS和klotho基因表达水平的关系,而我们的研究内容是在细胞实验的基础上,分析氧化应激对klotho基因启动子活性的影响。本实验以klotho基因的启动子区域作为切入点,研究klotho基因启动子的区域定位及其在不同细胞内的启动子活性,并结合生物信息学技术,初步预测klotho基因的可能的转录调控因子;接下来,应用H₂O₂模拟氧化应激模型,分析不同浓度的H₂O₂对klotho基因启动子活性的影响,以及klotho基因启动子活性变化与细胞抗氧化系统的关系。本研究的主要实验方法、实验结果:1.提取人的红细胞基因组DNA,以此为模板克隆klotho基因翻译起始位点上游-143～-6、-318～-6、-504～-6、-973～-6bp的片段（因为klotho基因的转录起始位点不只1个,定义翻译起始位点为0）,分别将4个klotho基因片段克隆到pGL₃-Basic报告基因载体中,构建重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,得到4个重组质粒,依次命名为:pGL₃-Basic-KLI、pGL₃-Basic- KLII、pGL₃-Basic-KLIII、pGL₃-Basic- KLIV。重组质粒经双酶切鉴定及测序鉴定,提示构建成功。将上述得到的重组质粒和海肾荧光素酶报告质粒pRL-TK共转染HEK293细胞和HeLa细胞,采用双荧光素酶检测系统检测相对荧光值。在HEK293细胞中,pGL₃-Basic-KLIII、pGL₃-Basic-KLIV的相对荧光值明显高于pGL₃-Basic空载体,有统计学意义（p<0.01）,提示该片段具有启动pGL₃-Basic报告基因转录的能力;pGL₃-Basic-KLIV和pGL₃-Basic-KLIII之间无统计学差异。在HeLa细胞中,pGL₃-Basic-KLIII的相对荧光值明显高于pGL₃-Basic空载体,有统计学意义（p<0.05）,与pGL₃-Basic-KLIII相比,pGL₃ -Baisc-KLIV的相对荧光值明显下降,有统计学差异（p<0.01）。2.克隆klotho基因翻译起始点上游-973～-6bp的片段,将该片段插入pGL₃-Basic报告基因载体中,构建重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,得到重组质粒,命名为pGL₃-Basic-KL。重组质粒经双酶切鉴定及测序鉴定,提示构建成功。将上述得到的重组质粒和pRL-TK共转染HeLa细胞,并用400、600、800、1000umol/L的H₂O₂刺激HeLa细胞,依次为1组、2组、3组和4组,无H₂O₂刺激组为对照组,分析各组的启动子活性、T-AOC、CAT、GSH-PX活性的变化。结果显示,与对照组比较,2、3、4组的klotho基因启动子活性显著下降,有统计学意义（p<0.01）。并且klotho基因启动子活性的下降与T-AOC、CAT、GSH-PX的活性下降呈正相关（r=0.805、0.812、0.944,P=0.000）。结论:1.klotho基因的核心启动子区域位于-504～-6bp;在HEK293和HeLa细胞中,pGL₃-Basic-KLIV的启动子活性不同,推测与基因转录的组织特异性和时间特异性有关,-973～-504bp区域可能是导致pGL₃-Basic-KLIV在HeLa细胞和HEK293细胞中启动子活性变化趋势出现差异的原因。2.H₂O₂模拟的氧化应激可以下调pGL₃-Basic-KL的启动子活性, klotho基因启动子活性的下降与氧化应激过程中抗氧化酶活性的下降呈正相关,提示klotho基因启动子和氧化应激抗性之间密切相关。