前言：缺血性脑血管疾病发生后，迅速进行溶栓是治疗成功的前提和基础，但溶栓治疗容易引起脑水肿，甚至脑出血，其主要原因是由于血脑屏障(blood brainbarrier，BBB)通透性增加，血脑屏障由脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞、基底膜等成分组成，其中相邻内皮细胞间的紧密连接(tight junction，TJ)是保持血脑屏障完整性的重要功能单位，是决定血脑屏障通透性的主要因素。紧密连接相关蛋白在紧密连接功能的调节中起重要作用，其在血管内皮细胞上的分布和/或表达水平影响紧密连接的开放或关闭。　　 强力霉素(Doxycycline)是半合成的第二代四环素族抗生素，有良好的脂溶性，能通过血脑屏障。强力霉素除具有广谱抗菌功能外，还有抑制小胶质细胞活化、抑制自由基产生、减少细胞凋亡等作用，是有效的神经细胞保护剂。我们推测强力霉素能够改善脑缺血再灌注大鼠血脑屏障的通透性，但这方面的研究尚未见报道。　　 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)是一组锌依赖性蛋白水解酶家族。研究表明缺血再灌注损伤伴有MMP-2(明胶酶A)和MMP-9(明胶酶B)的激活，MMP-2、MMP-9能够降解脑血管基底膜和紧密连接相关蛋白，使血脑屏障通透性增加。强力霉素能够抑制MMP-2、MMP-9蛋白表达和活性，但脑缺血再灌注大鼠应用强力霉素后MMP-2、MMP-9的活性变化与血脑屏障的通透性关系有待进一步证明。　　 蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是一类Ca2+、磷脂依赖性磷酸化酶，可催化各种蛋白质底物上的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化。研究证明PKCδ是脑缺血再灌注损伤中被迅速激活的细胞内信号分子，对再灌注损伤引起的炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等进行调节。PKCδ在缺血区脑微血管内皮细胞持续高表达，而在多种内皮细胞都发现PKCδ参与对紧密连接相关蛋白分布或表达的调节。　　 本研究利用脑缺血再灌注大鼠模型，腹腔注射强力霉素，研究脑缺血再灌注120h内，强力霉素对血脑屏障通透性的影响。　　 方法：　　 1、大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的制备。　　 2、应用激光多普勒血流仪检测血流变化。　　 3、氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色法检测脑梗死体积百分比，观察脑组织损伤情况及强力霉素的保护效应。　　 4、伊文氏蓝(evans blue，EB)检测强力霉素对脑缺血再灌注血脑屏障通透性的影响，透射电镜技术检测内皮细胞间紧密连接的状态。　　 5、免疫组织化学法检测强力霉素对脑缺血再灌注血脑屏障紧密连接相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1分布和表达的作用。　　 6、Western blot法检测强力霉素对脑缺血再灌注血脑屏障紧密连接相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1表达的调节作用；检测脑缺血再灌注脑组织MMP-2、MMP-9、PKCδ蛋白表达变化。　　 7、明胶酶谱法检测强力霉素对脑缺血再灌注脑组织MMP-2、MMP-9活性的影响。　　 结果：　　 1、脑缺血再灌注72h、120h，应用强力霉素使大鼠脑梗死体积显著降低。　　 2、脑缺血再灌注3h、12h、72h、120h，缺血区脑组织微血管内皮细胞间紧密连接开放，血脑屏障通透性显著升高，应用强力霉素大鼠未见紧密连接开放，强力霉素使血脑屏障通透性显著下降。　　 3、脑缺血再灌注3h、12h、72h、120h，缺血区脑组织血脑屏障紧密连接相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1表达显著下降，强力霉素使三种蛋白表达显著升高，并沿脑微血管分布明显增多。　　 4、脑缺血再灌注3h、120h，缺血区脑组织MMP-2蛋白表达和活性显著升高，脑缺血再灌注12h、72h，缺血区脑组织MMP-9蛋白表达和活性显著升高，强力霉素显著抑制了缺血再灌注引起的MMP-2、MMP-9蛋白的表达和活性上调。　　 5、脑缺血再灌注3h、12h、72h、120h，缺血区脑组织PKCδ蛋白表达显著升高，强力霉素显著抑制缺血再灌注引起的PKCδ蛋白表达上调。　　 讨论：本实验结果显示在脑缺血再灌注3h、12h、72h、120h，血脑屏障通透性显著升高，脑微血管内皮细胞间部分紧密连接开放，紧密连接相关蛋白claudin-5、occludin、ZO-1表达显著降低，沿脑微血管分布明显减少。强力霉素能够显著下调血脑屏障通透性，紧密连接结构保持完整，紧密连接相关蛋白claudin-5、occludin、ZO-1表达显著升高，沿脑微血管分布明显增多。该结果首次证明强力霉素通过上调紧密连接相关蛋白claudin-5、occludin、ZO-1表达和改变这些蛋白的分布对脑缺血再灌注大鼠血脑屏障通透性具有保护作用。同时本研究结果显示脑缺血再灌注后不同时间点MMP-2、MMP-9蛋白表达和活性显著升高，PKCδ蛋白表达显著升高，强力霉素能够显著抑制MMP-2、MMP-9蛋白表达和活性上调，显著抑制PKCδ蛋白表达上调。　　 紧密连接相关蛋白claudin-5、occludin、ZO-1在维持紧密连接的结构和功能中起重要作用，但它们有不同的分子结构和调节特性。occludin是第一个被分离出的紧密连接跨膜咬合蛋白，Claudins家族是由24个跨膜蛋白亚型组成的跨膜闭合蛋白，其中claudin-5在脑微血管内皮细胞表达丰富，occludin和claudin-5结构相似，细胞外部分都为四次跨膜结构，在相邻内皮细胞间形成两个环形结构，构成紧密连接的主密封带，两者直接参与紧密连接通透性的调节。ZO-1是MAGUK家族(含有鸟苷酸激酶区域或GUK结构域的一个家族)成员之一，在胞质内与occludin和claudin-5相互作用，将跨膜蛋白和细胞骨架连接在一起，是紧密连接支持结构的基础。同时分析三种蛋白的表达，能更有效说明其对紧密连接的影响。我们的结果显示，脑缺血再灌注3h、12h、72h、120h，紧密连接相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1分布与表达显著降低，说明此期间血脑屏障通透性升高与三种蛋白表达下调相关。强力霉素能够增加claudin-5、occludin和ZO-1表达水平并改变其分布，说明强力霉素通过上调claudin-5、occludin和ZO-1的表达，恢复紧密连接的结构完整性，降低血脑屏障通透性。　　 发生脑缺血再灌注损伤时，MMP-2、MMP-9蛋白表达增高，通过降解血管基底膜和紧密连接蛋白，增加血脑屏障的通透性。应用MMPs抑制剂或MMP-9基因敲除的小鼠可以减少脑组织损害和脑水肿的发生。本研究显示脑缺血再灌注后MMP-2、MMP-9的活性与表达呈现不同的变化特点，这与Rosenberg等报道结果一致，提示两者分别在脑缺血再灌注的不同时期影响血脑屏障的通透性。同时本结果提示强力霉素可能通过抑制MMP-2、MMP-9蛋白表达和活性，减少对紧密连接相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的水解作用，上调其表达并改变其分布，降低血脑屏障通透性。　　 构成血脑屏障的血管内皮细胞、星型胶质细胞、周细胞以及神经元、小胶质细胞都能分泌MMP-2、MMP-9无活性的前体，该前体分泌后被特殊蛋白酶切割而激活。氧化应激与炎症反应是引起缺血再灌注损伤的主要原因。前者引起活性氧生成增多，后者产生大量炎症介质，研究表明各种活性氧和IL-1β、IL-6、TNF-α等可以通过PKCδ途径从转录水平促进MMP-2、MMP-9表达上调。转录因子活化蛋白-1(activator protein-1，AP-1)、核转录因子-κB(nuclear transcription fator-kB，NF-κB)能够诱导MMP-2、MMP-9mRNA转录，促进其表达。强力霉素可能从转录水平和酶原活化几方面抑制MMP-2、MMP-9蛋白表达和活性的上调，例如，①通过PKC途径阻断AP-1与启动子结合，抑制MMP-2、MMP-9转录；②具有Zn2+或Ca2+螯合作用能够封锁MMP-2、MMP-9的结合位点，抑制MMP-2、MMP-9激活；③直接抑制MMP-2、MMP-9前体向活体形式转化等。　　 PKC途径参与脑缺血再灌注损伤的调节具有亚型特异性，其中PKCδ是介导脑缺血再灌注损伤的主要PKC亚型。特异性抑制PKCδ能够显著减少脑缺血再灌注损伤引起的受损神经元数目，PKCδ基因敲除的小鼠脑梗死体积显著小于野生型小鼠，且中性粒细胞渗出显著减少，提示PKCδ表达升高是脑缺血再灌注损伤中的一个有害因素。研究证明PKCδ磷酸化AP-1家族参与MMP-2、MMP-9的激活，在血脑脊液屏障PKCδ激活引起MMP-9活性增加，紧密连接相关蛋白表达下降，血脑脊液屏障通透性增加。PKCδ途径参与ZO-1丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化，使ZO-1在内皮细胞胞质中发生位移，破坏紧密连接结构引起血脑屏障通透性增高，应用PKCδ选择性抑制剂δV1-1能够增加ZO-1、occludin与细胞骨架之间的联系，减少对紧密连接结构的破坏。本实验结果显示PKCδ蛋白表达在脑缺血再灌注3h、12h、72h、120h显著增加，该结果提示脑缺血再灌注损伤有可能通过PKCδ途径参与对MMP-2、MMP-9蛋白表达或活性的上调，参与紧密连接蛋白磷酸化/表达的改变，增加血脑屏障通透性，应用强力霉素能显著抑制PKCδ蛋白表达的上调，提示强力霉素可能通过PKCδ途径参与对脑缺血再灌注血脑屏障通透性的调节。　　 综上所述，本研究结果证明强力霉素通过显著上调claudin-5、occludin和ZO-1的表达和改变这些蛋白的分布，起到保护脑微血管内皮细胞之间紧密连接结构的完整性，降低血脑屏障通透性的作用；强力霉素对claudin-5、occludin和ZO-1的分布和表达的调节作用可能与抑制MMP-2、MMP-9蛋白表达和活性、抑制PKCδ蛋白表达相关。　　 结论：　　 1、脑缺血再灌注3h、12h、72h、120h，血脑屏障通透性显著增加，脑微血管内皮细胞间紧密连接开放。　　 2、强力霉素显著降低脑缺血再灌注大鼠血脑屏障的通透性，对血脑屏障完整性具有一定保护作用。　　 3、强力霉素显著上调脑缺血再灌注大鼠血脑屏障紧密连接相关蛋白claudin-5、occludin和ZO-1表达。　　 4、强力霉素显著抑制脑缺血再灌注脑组织MMP-2、MMP-9蛋白的表达和活性上调。　　 5、强力霉素显著抑制脑缺血再灌注脑组织PKCδ蛋白的表达上调。