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β-半乳糖苷酶(β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶,β-D-galactoside galactohydrolase,EC3.2.1.23)通常被称为乳糖酶(Lactase),能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖,并具有半乳糖苷的转移作用.乳糖酶主要用于改良乳制品和生产低聚半乳糖,还可用于蛋白质合成与遗传因子等方面的研究,具有重要的实践价值和理论意义.目前,工业生产中使用的乳糖酶主要来源于乳酸克鲁维斯酵母菌、黑曲霉和米曲霉.该论文从一株乳酸克鲁维斯酵母菌中克隆获得乳糖酶基因,在大肠杆菌中进行表达并测定其酶学性质,同时也对利用巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)系统表达该基因进行了探索.研究内容及结果如下:1.乳糖酶基因的克隆及原核表达以乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)菌株k538的基因组DNA为模板,设计引物,利用PCR获得乳糖酶基因Klac,经DNA测序验证,得到克隆T1549.乳糖酶基因插入到表达载体pET-30a(+)上构建重组表达质粒pETlac4,将pETlac4电击转化到大肠杆菌BL21中,分别研究了阳性转化子在28℃、37℃下经IPTG诱导3h后的蛋白表达情况.表达产物的SDS-PAGE分析和酶活性测定表明,Klac基因在大肠杆菌中获得活性表达,其中低温条件28℃下的表达水平明显高于37℃,28℃诱导的细胞经超声波破碎所测酶活力为0.475U/mL,37℃仅为0.134U/mL.2.原核表达乳糖酶的酶学性质测定制备原核表达乳糖酶的原酶液.以ONPG为底物,分别测定了其最适pH值及pH稳定性、最适温度及热稳定性、金属离子和化学试剂的影响以及Km值和Vmax值.该酶最适pH值为5.8和6.4~7.5,属中性酶,碱性条件稳定,酸性条件不稳定;最适反应温度45℃~52℃,热稳定性较差,不适于高温反应;Fe<2+>、Mn<2+>、Co<2+>、Mg<2+>和Zn<2+>对乳糖酶有明显的激活作用,且该酶有一定的金属离子依赖性,Cu<2+>具有很强的抑制作用;37℃、pH6.6条件下K<,m>=1.143mmol/L,V<,max>=142.857nmol/min.3.乳糖酶基因K/ac在巴斯德毕赤酵母中表达将Klac基因插入到载体pPIC9上构建重组表达质粒PIC9154983,电击转化巴斯德毕赤酵母受体菌GS115,经筛选和PCR鉴定,1＃、8＃和24＃为重组菌株,Klac基因整合到GS115基因组中.三个重组菌株经甲醇诱导培养未检测到分泌的乳糖酶,但胞内均检测到有活性的乳糖酶,分别为0.1392U/mL、0.3702U/mL和0.2214U/mL,说明乳糖酶基因Klac在巴斯德毕赤酵母中获得表达.