论文部分内容阅读
针对金针菇子实体发育需低温诱导、季节性手工作坊受自然气候限制、工厂化栽培能源消耗巨大、紫杉醇资源匮乏且药源紧缺等问题，本研究采用紫外线、氯化锂、秋水仙素、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯等5种诱变剂和7种诱变方法，利用菌丝体生长阶段34℃高温初筛和子实体发育阶段20℃中温复筛的“两段”筛选方法，对5种金针菇栽培品种进行诱变，建立高温节能型金针菇诱变选育体系；选育高温节能型金针菇新品种；克隆紫杉醇生物合成途径中的重要酶基因；构建含金针菇内源gpd启动子和TwDBAT基因的真核表达载体，并采用PEG介导法将该载体遗传转化高温节能型金针菇原生质体，以获得能够表达外源TwDBAT基因的高温节能型金针菇工程菌株，为金针菇组合表达紫杉醇或紫杉醇前体物质的研究奠定基础。
本研究的主要结果如下：
1)确定了紫外线、氯化锂、硫酸二乙酯和甲基磺酸乙酯等4种诱变剂，对5种不同金针菇品种的致死率曲线，并从中筛选出2种对金针菇菌丝细胞具有诱变效果的诱变剂，即紫外线和甲基磺酸乙酯；
2)建立高温节能型金针菇诱变选育体系：在确定不同诱变剂对不同出发菌株的致死率曲线的基础上，用选定的诱变剂量反复大量诱变金针菇菌丝细胞，利用菌丝体生长阶段34℃高温初筛和子实体发育阶段20℃中温复筛的“两段”筛选方法，筛选高温节能型金针菇新菌株；
3)筛选出4株高温节能型金针菇新菌株(FLA1UV、FLA1EMS、FLA7EMS和FLA1UV+LiCl+EMS)；突变菌株菌丝均可33℃高温正常生长、在20℃以上可正常发育形成子实体；20℃出菇时，突变菌株FLA1UV+LiCl+EMS一潮生物学效率达37.83％，是原始对照亲本FLA1的7.77倍；
4)以中国特有濒危种南方红豆杉为材料，采用同源克隆的方法，成功克隆获得紫杉醇生物合成途径中4个重要酶基因的全长DNA序列(GGPP合酶基因、紫杉烯5α-羟基化酶、紫杉烷10β-羟基化酶和紫杉烷7β-羟基化酶)和1个全长cDNA序列(GGPP合酶基因)：
5)以表达载体pgFvs-mfc为骨架，通过SpeⅠ和BsrGⅠ酶切位点，将金针菇内源性启动子gpd-Fvs片段分别与3个功能基因GGPPS、TwDBAT、hph连接起来，经过PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定，成功构建了3个金针菇真核表达载体(pgFvs-GGPPS、pgFvs-TwDBAT和pgFvs-hph)；
6)建立了高效的金针菇原生质体制备与再生体系：液体培养5d的金针菇菌丝，以0.6 mol/LKC1作为稳渗剂，加入1.5%溶壁酶，在25℃下酶解金针菇菌丝3h时，分离得到的原生质体效果最佳，原生质体产量在5×107～8×108个/ml之间；采用预培养法，再生效果较好，在含有0.6 mol/L甘露醇的PDSA培养基中，原生质体再生率达6.32%；
7)采用PEG介导法，将真核表达载体pgFvs-TwDBAT和pgFvs-hph共转化高温节能型金针菇FLA7EMS菌株菌丝原生质体，经PCR和Southern杂交鉴定，有6株转化子的基因组DNA中整合了外源TwDBAT基因；
8)RT-PCR结果显示，6株转化子在mRNA水平上转录表达TwDBAT基因；
9)对获得的6株转化子进行菌丝体遗传稳定性研究，结果表明：6株转化子在菌丝继代转接10次后，PCR检测均能检测到TwDBAT基因的存在，初步推断转化子菌丝体是可以稳定遗传的；
10)经HPLC结果初步分析，转化子异源表达的TwDBAT酶蛋白可以催化底物10-去乙酰巴卡亭Ⅲ。