番茄E3泛素连接酶SlSL1功能分析

来源 :合肥工业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:stong_sz
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植物的泛素化途径在其生长发育和对内外环境信号应答调控中发挥重要作用。泛素分子在多种酶的协作下结合于靶标蛋白,实现泛素化标记蛋白质的降解或修饰。其中决定靶标蛋白特异性的E3连接酶以复合物或单亚基形式发挥泛素连接功能,对番茄单亚基形式E3连接酶的研究相对较少。番茄SlSL1(Solanum lycopersicum SINA-like 1)基因具有RING型E3连接酶结构域,但对其泛素连接酶活性及生物学功能尚未分析。本文通过克隆番茄SlSL1基因、构建原核重组表达质粒,并利用诱导表达、亲和吸附纯化SlSL1重组蛋白,以此进行SlSL1的体外泛素化活性检测。SDS-PAGE电泳及蛋白印迹结果显示,由所构建番茄SlSL1原核表达质粒纯化获得了预期SlSL1重组蛋白;体外泛素化反应中SlSL1形成多聚化泛素条带,表明其可以进行自身泛素化,具有E3泛素连接酶功能。通过构建pBI121-SlSL1过表达遗传转化载体,利用农杆菌介导遗传转化将具有E3连接酶活性的SlSL1基因在番茄中过量表达。经定量PCR检测,获得了SlSL1过表达番茄株系。与野生型相比,转基因幼苗的生长发育未显示明显差异。但接种丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)菌株Pst DC3000后,SlSL1过表达植株对病原菌的抗性显著高于野生型,叶片病斑减少,病原菌增殖数目明显降低,提示SlSL1通过泛素化途径参与番茄抗病防御反应。为进一步探讨SlSL1所调控靶标蛋白,利用番茄多种组织所构建酵母双杂交文库,对SlSL1互作蛋白进行筛选。初步获得6个候选靶标序列:polyubiquitin、ubiquitin-60S ribosomal protein L40、IQ-DOMAIN 14-like、glycine-rich protein 2-like、glycosyltransferase、hsp70-Hsp90 organizing protein 2,为探讨番茄SlSL1基因作用机制提供了线索。此外,SlSL1过表达对番茄植株生长、开花时间、果实重量、大小,以及果实和种子发育均未有明显不利影响,但可增强番茄对病原细菌的防御能力,具有遗传改良应用潜力。因此本工作为深入研究番茄E3泛素连接酶SlSL1的免疫应答调控功能及其作用机制奠定了重要基础,也为番茄抗病遗传改良提供了新的基因资源。
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