论文部分内容阅读
目的该研究运用比较蛋白质组学的策略从人肺腺癌细胞株和耐顺铂细胞株中寻找与耐药有关的泛素化蛋白，以期从蛋白质组学水平为探索肺癌细胞顺铂耐药时泛素-蛋白酶体途径的的改变提供新的实验依据。方法1.评价耐药细胞模型。通过MTT法，透射电镜，倒置显微镜，流式细胞仪检测经过顺铂处理后，人肺腺癌A549和耐顺铂细胞株A549/CDDP耐药性，形态，周期和凋亡的变化，评价A549/CDDP是否是成功的耐药细胞模型。2.以亲和色谱法从A549细胞和A549/CDDP细胞裂解液中捕获、富集泛素化蛋白质后，通过1D SDS PAGE分离，Quality One分析图谱，选取45-85kDa的差异表达条带，胰蛋白酶酶解后，进行HPLC-CHIP-MS/MS分析，鉴定差异表达蛋白。3.筛选有意义的蛋白质，通过Western Blot，激光共聚焦技术验证质谱分析结果。结果1. A549细胞株和A549/CDDP细胞株经顺铂处理后，A549细胞密度明显降低，细胞出现皱缩，变圆；细胞生长受到明显抑制，生存率明显降低；细胞里有凋亡小体出现，呈典型的凋亡形态学特征；凋亡率明显增加，且G2期细胞明显增加。A549/CDDP没有明显的变化。2. HPLC-CHIP-MS/MS鉴定了11种蛋白质，其中，有7种是可能发生了单-泛素化或多-泛素化的底物蛋白质，4种是E3泛素蛋白连结酶相关蛋白。这4种蛋白分别使RNF6、LRSAM1、TRIM25和PKM2。3.Western blotting和激光共聚焦进行验证的结果表明，RNF6、LRSAM1、TRIM25三种E3泛素蛋白连结酶在A549细胞中的表达均明显低于在A549/CDDP细胞中的表达；顺铂（CDDP）作用后，在两种细胞株中，三者的表达均明显下调，而在A549/CDDP细胞中，CDDP作用后的表达下调幅度较小。底物蛋白PKM2在A549细胞中的表达明显高于在A549/CDDP细胞中的表达；CDDP作用后，PKM2在A549细胞中的表达上调，在A549/CDDP细胞中的表达下调。结论研究工作从蛋白质水平提示，在人肺腺癌细胞株中，耐药与泛素化过程的改变密切有关。