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IL-10~+调节性B细胞(Breg)通过分泌白介素-10(IL-10)在抑制过度炎性反应方面起到重要作用。然而调节性B细胞因在体内含量少,没有特异性表面标记,没有特异性转录因子,和分化发育机制不清楚等限制其将来临床应用。为了进一步深入研究调节性B细胞的分化发育机制,本研究首先关注了一个关键的科学问题:哪些转录因子能有效地调控调节性B细胞关键的标志性分子—IL-10的表达?目的:分析IL-10启动子上转录因子结合位点,检测Foxd3(经预测是结合在IL-10启动子上得分最高和结合位点最多的一个转录因子)在调节性B细胞中与IL-10分泌的相关性,阐明“Foxd3在调节性B细胞分化、发育、扩增及功能中的作用及机制”,并为靶向Foxd3信号通路促使调节性B细胞扩增及其对自身免疫病治疗提供理论及实验依据。方法:(1)通过两个网站为基础的预测软件,对IL-10启动子上转录因子结合位点进行分析;(2)应用染色质免疫共沉淀-PCR技术验证Foxd3是否能够直接结合在IL-10启动子上;(3)应用基因突变技术进一步证实Foxd3与IL-10启动子结合的具体相互作用位点;(4)通过双荧光素酶报告系统分析Foxd3是否调节IL-10启动子的活性;(5)应用实时定量PCR和免疫印迹技术检测LPS活化的B细胞中Foxd3的mRNA水平和蛋白水平表达;(6)应用Foxd3特异性shRNA敲低B细胞中Foxd3的表达,检测Foxd3表达降低是否影响IL-10的表达;(7)通过流式细胞术、酶联免疫吸附实验和免疫印迹技术,检测系统性红斑狼疮小鼠B细胞中Foxd3和IL-10表达的相关性。结果:(1)对小鼠IL-10启动子上转录因子结合位点进行分析,发现Foxd3是与IL-10启动子结合最强(得分最高)和最多(结合位点最多)的转录因子;(2)染色质免疫共沉淀-PCR技术鉴定出Foxd3能结合在IL-10启动子上游-1400bp位置;(3)通过构建截短型IL-10启动子,证明Foxd3通过与IL-10启动子结合位点p4(-1413)结合;通过构建截短型Foxd3蛋白,证实Foxd3通过一个N末端结构域结合在IL-10启动子上;(4)双荧光素酶报告系统分析显示,Foxd3能有效地抑制IL-10启动子的功能;(5)实时定量PCR和免疫印迹技术证实LPS活化的B细胞高表达Foxd3 mRNA和蛋白,并且Foxd3的表达随着LPS的刺激呈时间依赖性增加;(6)实时定量PCR、免疫印迹技术、流式细胞术和酶联免疫吸附实验检测结果显示Foxd3低表达的IL-10~+调节性B细胞中IL-10的表达升高;(7)流式细胞术、酶联免疫吸附实验和免疫印迹技术结果表明,系统性红斑狼疮小鼠B细胞中Foxd3表达量升高而IL-10~+调节性B细胞降低。结论:本研究表明无论是在体内还是体外,活化的B细胞上调Foxd3的表达。Foxd3通过直接结合IL-10的启动子,限制IL-10启动子的激活,进而抑制IL-10~+调节性B细胞的产生。自身免疫病小鼠B细胞高表达Foxd3进而降低调节性B细胞的产生。这样,转录因子Foxd3通过抑制B细胞中白介素-10的表达抑制调节性B细胞的产生。这项研究不仅阐明了Foxd3抑制调节性B细胞产生的机制,而且为以Foxd3为潜在靶点诱导调节性B细胞产生来治疗自身免疫病的新方法奠定前期基础。因此,这项研究既丰富了调节性B细胞分化发育的基本理论又为调节性B细胞的可能应用奠定了坚实基础。