论文部分内容阅读
目的1.初步阐明新生期母爱剥夺（Neonatal Maternal Deprivation, NMD）诱导的成年大鼠内脏痛过敏中脊髓背根节神经元上电压门控性钠通道表达和功能的变化特征。2.探讨内源性硫化氢合酶胱硫醚-β-合成酶（CBS）在慢性内脏痛中的作用及其对电压门控性钠通道表达和功能调控的影响。方法1.新生鼠从出生后第2天开始到第15天，处理组和母鼠分离，每天分开3个小时，对照组不做处理。运用这种方法诱导大鼠的内脏痛过敏模型。运用腹壁撤回评分（AWR score）方法评测NMD大鼠的痛行为反应。腹腔注射CBS阻断剂羧甲基羟胺半盐酸（AOAA），同样运用以上腹壁撤回评分方法评测大鼠的痛行为反应，从而检测H2S在慢性痛模型中的作用。2.结肠管壁注射荧光素（DiI）来标记肠特异性背根神经节（DRG）神经元，运用全细胞膜片钳方法研究大鼠肠相关神经元兴奋性及电压依赖性钠通道电流的变化特性。3.运用Western Blotting，免疫组织化学，Quantitative Real-time PCR的实验方法检测大鼠肠相关DRG神经元中NaV1.8，NaV1.9以及CBS蛋白和mRNA表达情况。结果1. NMD显著增加成年大鼠对直结肠扩张的反应性，表现在AWR分数的显著增加以及痛阈的降低。腹腔注射H2S合酶CBS的拮抗剂AOAA后，可以显著降低实验组大鼠的AWR分数，并呈现剂量和时间依赖性。2.全细胞膜片钳记录显示，与对照组相比，NMD显著增加肠相关DRG神经元（T13-L2）的兴奋性；进一步检测显示NMD显著增加TTX-R钠通道的电流密度，而TTX-S钠电流密度没有明显变化。3.数据分析后显示，和对照组相比，NMD组的激活曲线显著左移，而失活曲线没有显著变化。另外，NMD处理后，TTX-R钠通道的激活时间显著缩短，失活时间没有显著变化。4. NMD处理组7周大鼠肠相关DRG神经元（T13-L2）中，NaV1.8受体蛋白表达显著增加，肠相关DRG神经元中NaV1.8的mRNA总量没有显著变化。5.连续腹腔注射AOAA可以显著翻转NMD组大鼠肠相关DRG神经元的兴奋性，还可以显著降低TTX-R的钠通道的电流密度，并使TTX-R钠通道的激活曲线右移。另外AOAA还可以显著降低NMD引起的肠DRG神经元中NaV1.8的高表达。6.外界灌流H2S的供体NaHS,可以显著增加正常大鼠肠相关DRG神经元的兴奋性，还可以显著增加TTX-R钠通道的电流密度，使TTX-R钠通道的激活曲线左移。另外，给与PKA的拮抗剂H-89可以显著降低NaHS引起的电流密度的增加。结论以上实验结果表明H2S合酶CBS可能是通过PKA介导的TTX-R钠通道的激活和NaV1.8蛋白的高表达，从而增加TTX-R钠通道的电流密度，导致肠相关DRG神经元兴奋性的增加进而参与到外周痛觉信号的调制，最终导致内脏痛过敏。因此本研究在一定程度上揭示了功能性胃肠疾病如IBS病人慢性内脏痛产生的分子机制，从而可能为慢性内脏痛的治疗提供了更有效的方案。