研究背景新生命的孕育始于卵子和精子的结合。卵子和精子的受精发生在输卵管的壶腹部,受精卵在输卵管向子宫移动的过程中经历卵裂发育为桑椹胚。在受精后4-5天发育为囊胚,此时已到达子宫腔,囊胚由位于内部的内细胞团和外部的滋养外胚层组成,日后滋养外胚层发育为胎盘,内细胞团发育为胎儿。胎盘是一个临时性器官,但是在母体整个妊娠过程中起着举足轻重的作用。胎儿的正常发育离不开胎盘,胎盘是联系母体与胎儿的纽带,对于母胎的健康至关重要。胎盘的发生发育出现异常则会导致妊娠相关疾病的发生,包括子痫前期(pre-eclampsia)、早期流产(first trimester miscarriage)和胎儿发育迟缓(fetal growth restriction),严重时可导致胎儿死亡。因此,胎盘的正常发育和其功能的正常调控对于人类妊娠过程中胎儿的正常发育非常重要。细胞融合是哺乳动物常见的生理过程,它参与受精、胎盘发育、骨骼肌和骨头的发育以及免疫防御反应。在卵子和精子结合的过程中,精子穿过透明带后继续穿过卵细胞的细胞膜,受精卵形成的这个过程发生了精子与卵细胞的融合。在人类胎盘绒毛发育过程中,同样也存在细胞融合事件的发生。囊胚种植入子宫后,接下来的胎盘发育开始出现胎盘绒毛。在胎盘绒毛的形成过程中,细胞滋养层细胞主要沿着两条途径分化。侵润迁移途径：细胞滋养层细胞(cytotrophoblast, CTB)分化为具有侵润能力的绒毛外滋养层细胞(extravillouscytotrophoblast, EVT)向母体子宫发生侵润;融合途径：胎盘绒毛细胞滋养层细胞中有一类具有增殖分化能力的细胞,这类细胞可分裂为两个细胞,其中一个与外围的合体滋养层(syncytiotrophoblast, STB)发生融合,而另一个细胞继续保持有丝分裂特性。在细胞滋养层细胞融合到合体滋养层的过程中,细胞滋养层细胞不仅将其细胞核融进合体滋养层,还有胞质中的细胞器包括线粒体、内质网、高尔基体等所有物质都进入了合体滋养层。细胞滋养层细胞不断持续融入合体滋养层的这种特性能够让合体滋养层的表面积不断扩大,同时更新现有的合体滋养层,使得合体滋养层中老化的部分代谢到母体血液循环中完成自身的新陈代谢从而实现胎盘的发育和成熟。老化的内容物和凋亡的物质聚在一起形成合体滋养层结节,这种结节将从合体滋养层排放到母体血液中从而维持的合体滋养层稳态。这对于胎儿胎盘的新陈代谢是至关重要的。如果细胞融合失去控制,导致合体滋养层凋亡或坏死物质大量的排到母体血液中则有可能引起母体妊娠炎症反应过度,导致妊娠疾病如子痫前期等的发生。胎盘是母体与胎儿进行气体交换、供应营养物质和排除代谢产物的场所。大约在受精后第3周末,绒毛内的中胚层分化出毛细血管形成三级绒毛,此时开始胎儿胎盘循环系统的建立。绒毛间隙充满了由母体子宫螺旋动脉提供的血液,子宫螺旋动脉的血液富含氧气及胎儿发育所需的营养物质。位于绒毛外层的合体滋养层可与子宫螺旋动脉血直接接触,进行营养物质、代谢物和气体的交换。同时合体滋养层还可以阻碍来自于母体病原体的进入,如抵抗李斯特细菌等病原体。若合体滋养层结构遭到破坏,来自母体血液的病原体则可能入侵,影响胎儿的生长与发育。胎盘同时还是一个具有代谢和内分泌功能的器官,可合成各种激素,包括绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)、胎盘催乳素(human placental lactogen, hPL)、雌激素、孕激素和胎盘生长因子等。这些分子的正常合成及分泌对于胎盘的正常发育和功能的发挥以及妊娠的维持等各个方面起着至关重要的作用。气体、营养物质在母体与胎儿的正常交换、母体病原体进入胎儿受到的阻碍以及以上激素的正常分泌依赖于合体滋养层结构的正常发育,形成良好的胎盘屏障结构,充分保证了胎儿发育的正常进行。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition. EMT)是上皮细胞转化为具有活动能力、能够在细胞基质间自由移动的间质细胞的过程。EMT中最典型的特征是E-cadherin的降低或缺失。研究发现一些转录因子包括Snail、Slug、 ZEB1、ZEB2以及Twist1可通过抑制E-cadherin的表达促进上皮向间质的转化。这些转录因子被称为EMT相关因子。本研究团队之前已报道Cullin7通过调控ZEB1和Slug的表达,从而促进胎盘绒毛中滋养层细胞的侵润迁移,滋养层细胞的EMT转化。其他研究也发现EMT相关因子,包括Twist1、Snail和Slug在胎盘绒毛中滋养层细胞的侵润迁移分化过程中发挥重要的作用。以上研究表明EMT相关因子(ZEB1、Twist1、Snail和Slug)在滋养层细胞的侵润迁移过程中发挥重要作用,但这些EMT相关因子在绒毛中滋养层细胞分化的融合途径中是否也发挥同样重要的作用,这方面的研究报道不多。因此,本实验的研究目的主要是检测EMT相关因子在胎盘绒毛中细胞滋养层细胞融合分化途径中的作用。通过实验研究我们证实了转录蛋白Twist1参与了滋养层细胞的融合分化过程,并在其中发挥着重要的作用。并首次研究发现了Twist1可在转录水平上调控GCM1的表达从而促进滋养层细胞的融合。EMT相关因子Twist1不仅在胎盘母胎界面促进上皮.间质的转化,在滋养层细胞的另一条分化途径中(融合途径)同样发挥重要的生理功能。这些研究结果将有助于我们进一步了解胎盘滋养层融合发生及胎盘形成的分子机制。深入研究胎盘形成的生理机制为临床上预防胎盘发育异常引起的妊娠相关疾病提供分子理论基础,更加深入了解妊娠相关疾病发生的病理机制,为日后治疗妊娠相关疾病提供更多、更加有效的治疗方法。第一部分Twist1在人类胎盘滋养层细胞融合过程中的作用[研究目的]通过检测EMT相关分子在人类胎盘绒毛滋养层细胞自发合体化过程中的表达情况,探讨EMT相关分子在人类胎盘绒毛滋养层细胞融合过程中的作用,有利于我们进一步了解胎盘发育过程中滋养层细胞的融合分化途径。[研究方法]2014年5月至2015年5月从北京妇产医院收集人类胎盘,包括妊娠早期人工流产绒毛(6-8周)、妊娠中期引产的正常胎盘(18-20周)和足月分娩的胎盘(38-40周)。从足月胎盘中分离原代滋养层细胞,建立原代滋养层细胞自发合体化模型。原代滋养层细胞培养期间,收集不同时间点的细胞,通过实时定量PCR和蛋白免疫印迹方法检测p型人绒毛膜促性腺激素(p-hCG)的mRNA水平及蛋白表达水平,运用免疫荧光方法检测原代滋养层细胞合胞体的形成确定原代滋养层细胞自发合体化模型的成功建立。利用实时定量PCR检测EMT相关因子(Twist1、Snail、Slug、ZEB1和ZEB2)在原代滋养层细胞自发合体化过程中的表达变化。运用免疫组化方法检测EMT相关因子Twist1在妊娠早期绒毛、妊娠中期胎盘及足月胎盘的表达定位。通过蛋白免疫印迹方法检测原代滋养层细胞自发合体化过程中及forskolin (FSK)诱导BeWo细胞融合过程中的Twist1的蛋白表达水平。使用特异性siRNA靶向抑制BeWo细胞中Twist1的表达24小时,随后FSK诱导BeWo细胞融合48小时。观察其对FSK处理的BeWo细胞融合过程的影响,包括合胞体的形成及β-hCG的蛋白表达水平。[研究结果](1)免疫荧光显示原代滋养层细胞在培养的过程中会自发聚集形成合胞体。随着培养时间的延长,滋养层细胞形成的合胞体越大,72小时后合胞体中的细胞核数可达10个以上。β-hCG的mRNA水平及蛋白表达水平随着滋养层细胞自发合体化的进程而逐渐升高。(2)实时定量PCR检测显示EMT相关因子Twist1的mRNA水平在原代滋养层细胞自发合体化过程中其表达显著性升高,而其他EMT相关因子(Snail、Slug、ZEB1和ZEB2) mRNA水平显著性降低。(3)在妊娠不同时期胎盘绒毛中转录因子Twist1主要表达在细胞滋养层细胞、合体滋养层及绒毛间质细胞,具有明显的核定位信号。(4)Western blotting显示原代滋养层细胞自发合体化过程中,Twist1的蛋白表达水平在24小时已明显升高并持续至72小时。FSK诱导Be Wo细胞融合过程中,与对照组相比较(DMSO), Twist1的蛋白表达水平升高。(5)特异性siRNA靶向抑制Twist1的表达,与对照组(scrambled siRNA)相比较,FSK处理的BeWo细胞的β-hCG蛋白表达水平降低,形成的合胞体数减少,融合指数显著降低。[研究结论](1)足月胎盘分离得到的原代滋养层细胞培养过程中滋养层细胞自发融合形成合胞体,表明了人胎盘原代滋养层细胞自发合体化模型的成功建立。(2)EMT相关因子Twist1的mRNA水平及蛋白表达水平随着原代滋养层细胞自发合体化的进程而升高,并且在妊娠不同时期的胎盘绒毛中的细胞滋养层和合体滋养层都有明显的核定位信号。提示了Twistl可能参与了合体滋养层的形成。(3)利用人绒毛膜癌滋养层细胞系BeWo细胞进行功能实验,发现靶向抑制Twistl的表达后,抑制FSK诱导的BeWo细胞融合,融合指数显著降低,且合成分泌的β-hCG减少。进一步证实了Twist1在滋养层细胞融合过程中的重要作用。第二部分Twist1通过调控GCM1表达促进滋养层细胞的融合[研究目的]本课题第一部分已经初步证实了在人类胎盘绒毛发育过程中Twist1可促进细胞滋养层细胞的融合发生。但目前对于Twist1调控滋养层细胞发生融合的作用机制鲜有报道。GCM 1是目前公认的可促进人类胎盘绒毛中细胞滋养层细胞向合体滋养层发生融合的分子。本部分实验主要探讨Twist1是否通过调控GCM1表达促进滋养层细胞的融合,研究Twistl促进滋养层细胞融合的分子机制。[研究方法]运用免疫组化方法检测Twist1和GCM1在人类早期妊娠绒毛中的表达定位。从人类足月胎盘绒毛中分离得到的原代滋养层细胞分别在常氧(20%)和低氧(2%)条件下培养至72小时,培养期间收集不同时间点的细胞,通过实时定量PCR和蛋白免疫印迹方法检测不同培养条件下Twist1、GCM1和β-hCG的表达情况。使用特异性siRNA靶向抑制BeWo细胞中Twist1的表达,然后FSK诱导BeWo细胞融合48小时。运用实时定量PCR观察Twist1 siRNA对FSK处理的BeWo细胞融合过程中GCM1以及下游分子syncytin1和syncytin2的mRNA表达水平的影响。在293T细胞中共同转染表达Twist1的质粒及插入GCM1基因第二内含子区域的报告质粒,利用荧光素酶报告实验检测了不同总量的Twist1质粒对GCM1转录活性的影响。进一步通过染色质免疫共沉淀实验研究Twist1蛋白与GCM1靶基因的相互作用。[研究结果](1)免疫组化结果显示Twist1和GCM1在人类妊娠早期绒毛中具有相似的表达定位,在妊娠早期绒毛的细胞滋养层和合体滋养层都有表达,具有明显的核定位信号。(2)与常氧(20%)培养条件相比,从足月胎盘分离得到的原代滋养层细胞在低氧(2%)条件中培养时,融合能力受到影响,表现为β-hCG蛋白的表达水平受到抑制。在常氧(20%)培养条件下,随着培养时间的延长,原代滋养层细胞的Twist1蛋白表达水平升高及GCM1的mRNA水平显著升高。而在低氧(2%)培养条件下,Twist1蛋白的表达水平及GCM1的mRNA水平同时受到抑制。(3)在人绒毛膜癌来源的细胞系BeWo细胞中特异性地敲低Twist1的表达,GCM1在siRNA实验组的mRNA水平显著降低。GCM1下游分子syncytin 1和syncytin 2的mRNA水平在siRNA实验组亦显著降低。(4)在293T细胞中共转染了过表达Twist1质粒和GCM1报告质粒,荧光素酶报告实验发现Twist1影响了GCM1的转录活性,具有增强GCM1转录活性的作用,并且随着转染过表达Twist1质粒总量的增加,GCM1的转录活性也随着升高。(5)BeWo细胞中加入FSK诱导融合48小时后,通过染色质免疫共沉淀实验发现转录因子Twist1可以与位于GCM1基因第二内含子中的E-box序列结合。[研究结论](1)Twist1和GCM1在妊娠早期绒毛中相似的表达定位,并且在不同氧气浓度培养条件下,Twist1和GCM1表达水平的变化趋势具有相似性,推测Twist1和GCM1之间是否存在可能的联系。(2)在BeWo细胞中特异性敲低Twist1的表达后,GCM1及其下游分子syncytin 1和syncytin 2的mRNA水平在siRNA实验组显著降低,提示Twist1可能通过调控GCM 1的表达促进滋养层细胞的融合。(3)为了进一步验证了以上假设,通过荧光素酶报告实验发现Twist1可增强GCM1的转录活性。同时,染色质免疫共沉淀研究结果显示Twist1可与GCM1基因的第2内含子中富含E-box序列的区域结合。综上所述,Twist1可能通过与GCM1基因第2内含子中的E-box序列结合,从而调控GCM1的表达,促进滋养层细胞的融合。