研究背景与目的目前,肺癌已经成为全球最为常见的癌症之一,具有高发病率与高死亡率的特征。其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者约占85%以上。虽然近年来医学上肿瘤治疗取得了很大的进展,但肺癌患者的5年生存率依然很低。据统计分析,超过90%的肺癌患者死亡的原因是癌细胞的转移。在癌细胞转移过程中,上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)发挥着重要的作用。这使得对EMT的相关分子机制的研究显得尤为重要。EMT的发生是一个复杂的过程,涉及到多条信号通路的协同调控。其中,transforming growth factor(TGF)-β信号通路在诱导癌细胞发生EMT的过程中发挥着重要的作用。之前的研究证实,IL-6/JAK/STAT3信号通路可以促进TGF-β信号通路,并进而促进TGF-β诱导的EMT。但在两条通路发生协同作用时,其内在的分子机制仍不是很清楚。本文旨在揭示在两条信号通路中起着桥梁作用的关键分子,进而为NSCLC发生EMT提供一定的分子机制,为NSCLC的治疗提供一定的理论基础。研究方法(1)实时荧光定量PCR筛选受IL-6影响表达的TGF-β信号通路蛋白。(2)Western blot验证筛选到的蛋白(TβRIII)是否在蛋白水平上发生变化。(3)利用AG490抑制IL-6/JAK/STAT3信号通路,Western blot检测其对TβRIII蛋白水平变化的影响。(4)用IL-6/AG490、TGF-β刺激A549细胞,Western blot检测TβRIII、SMAD3、p-SMAD3、Snail蛋白的变化(5)用转染干扰RNA的方法敲弱TβRIII在肺癌细胞中的表达,检测其对TGF-β信号通路的影响以及对TGF-β诱导的EMT的影响(6)运用细胞划痕、Transwell的方法检测不同处理对肺癌细胞的迁移能力的影响。研究结果(1)通过对肺癌细胞A549用50ng/ml的IL-6刺激24h,实时定量检测TGF-β信号通路上游分子m RNA表达量变化,发现TβRIII在m RNA水平上显著升高,具有统计学意义(p<0.01)。(2)在蛋白水平上检测TβRIII是否受IL-6的影响。Western blot结果显示,相比于对照组,TβRIII在蛋白水平上有着明显的升高。(3)判定IL-6促进TβRIII的表达是否通过IL-6/JAK/STAT3信号通路。用50um/ml的AG490(JAK激酶抑制剂)处理A549细胞,Western blot显示TβRIII的表达量显著降低。表明TβRIII的表达受IL-6/JAK/STAT3信号通路的调控。(4)用IL-6与TGF-β处理A549细胞,Western blot检测TβRIII、SMAD3、p-SMAD3、Snail蛋白的变化,发现伴随着TβRIII表达量的升高,p-SMAD3、Snail的表达量也同时升高。说明IL-6在促进TGF-β/SMAD3信号通路的同时,TβRIII的表达量升高。(5)用AG490与TGF-β1处理A549细胞后,同样检测TβRIII、SMAD3、p-SMAD3、Snail蛋白表达量的变化,发现TβRIII、p-SMAD3、Snail表达量同时降低。进一步证明IL-6/JAK/STAT3信号通路促进TGF-β/SMAD3信号通路时伴随着TβRIII的表达上调。(6)通过在A549细胞中转染si RNA,敲弱TβRIII的表达,检测其是否促进TGF-β/SMAD3信号通路以及TGF-β诱导的EMT。结果显示,相比于对照组,实验组p-SMAD3、N-cadherin表达量降低,E-cadherin表达量升高。说明在TGF-β/SMAD3信号通路中,TβRIII起到促进作用,并且促进TGF-β诱导的EMT。(7)在敲弱TβRIII的A549细胞株中,通过细胞划痕、Transwell实验检测TβRIII对TGF-β诱导细胞迁移能力的影响。结果显示敲弱TβRIII后,TGF-β对NSCLC细胞迁移能力的促进作用被减弱。研究结论本研究以NSCLC细胞为研究材料,揭示了IL-6/JAK/STAT3信号通路在促进TGF-β/SMAD3信号通路以及其诱导的EMT与迁移的过程中,TβRIII发挥的关键桥梁。TβRIII在TGF-β/SMAD3信号通路中扮演着促进信号通路的角色,从而使IL-6/JAK/STAT3、TGF-β/SMAD3信号通路在诱导NSCLC发生EMT的过程中显示出协同作用。本文通过对两条信号通路之间相互作用的研究,初步阐明两条信号通路相互关联的作用机制,为临床NSCLC的诊断、治疗提供一定的理论基础。