[目的]食品安全关系到人体的健康、经济的发展以及社会的稳定,随着兽药在养殖业的应用,其毒副作用随之显现出来,对食品安全构成潜在威胁,因此对兽药残留进行监测,在保障食品安全、保护人群健康等方面具有重要意义。目前对济南市区市售动物性食品中涵盖多种兽药残留的现状调查鲜有报道,为了解济南市区市售动物性食品中兽药残留安全现状,本研究拟建立一系列准确、灵敏、高效、稳定且能同时检测同一类兽药残留的高效液相色谱法,同时制定科学、合理的随机采样方法,对济南市售动物性食品中的四类10种兽药[四环素类(Tetracyclines, TCs)包括土霉素(Oxytetracycline, OTC)、四环素(Tetracycline, TC)、金霉素(Chlortetracycline, CTC),磺胺类(Sulfonamides, SAs)包括磺胺嘧啶(Sulfadizazine, SD)、磺胺二甲基嘧啶(Sulfamethoxazole、磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole, SMZ),喹诺酮类(Quinolones, QNs)包括氧氟沙星(Ofloxacin, OFL)、环丙沙星(Ciprofloxacin, CIP)、恩诺沙星(Enrofloxacin, ENR),盐酸克伦特罗(Clenbuterol Hydrochloride, CL)]残留进行调查,对超标情况进行分析,从而了解济南市区市售动物性食品中的兽药残留水平及现状,继而制定相应监管措施、为消费者安全食用动物性食品提供指导建议。[方法]1动物性食品中四类兽药残留检测方法学研究1.1四环素类兽药残留检测方法1.1.1样品处理切碎匀浆后的样品用5%高氯酸溶液沉淀蛋白,加入EDTA-Mcllvaine缓冲溶液消除金属离子的干扰,经离心、浓缩后,加乙腈-水(6：4)溶解残渣,采用高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)检测。1.1.2色谱条件色谱柱：Agilent C18柱(150mm×5mm,4.6μm)；流动相：乙腈+0.01mol/L磷酸二氢钠(pH=2.5)；柱温：25℃；检测波长：273nm;流速：1.2ml/min;进样量：20μl；色谱柱清洁和平衡时间约为5min。洗脱梯度程序：0-3min,乙腈:0.01mol/L磷酸二氢钠=13：87(V:V)；3～12min,乙腈:0.01mol/L磷酸二氢钠=25：75(V:V)。1.2磺胺类兽药残留检测方法1.2.1样品处理切碎匀浆后的样品经乙腈提取,提取液离心后上清液经萃取去除杂质,萃取液经浓缩后,流动相定容,采用高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)检测。1.2.2色谱条件色谱柱：SHIMADZU VP-ODS C18(250mm×4.6mm,4.6μm)；流动相：乙腈：1%乙酸溶液=22：78(V:V)；流速：1.2ml/min；柱温：25℃；进样量：20μ1；检测波长：268nm。1.3喹诺酮类兽药残留检测方法1.3.1样品处理切碎匀浆后的样品经酸化后的乙腈,超声提取,正己烷多次萃取除去杂质,样品浓缩后加乙腈-水(8：2)溶解,采用高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)检测。1.3.2色谱条件色谱柱：SHIMADZU VP-ODS C18柱(250mm×4.6mm,4.6μm)；流动相：乙腈+0.01mol/L磷酸二氢钠溶液(pH=4.0),柱温：25℃；检测波长：279nm；进样量：20μl；梯度洗脱程序为：0～2min,乙腈:0.01mol/LNaH2PO4=1:99(V:V),流速：1.0ml/min;2～2.5min,乙腈:0.01mol/LNaH2PO4=13:87(V:V),流速：1.1ml/min;2.5～16.5min,乙腈:0.01mol/LNaH2PO4=13:87(V:V),流速：1.2ml/min。30%乙腈清洁和1%乙腈平衡色谱柱的时间约为10min。1.4盐酸克伦特罗兽药残留检测方法1.4.1样品处理切碎匀浆后的样品经0.1mol/L高氯酸沉淀蛋白,超声提取,上清液用1mol/L NaOH溶液调节pH值至8.7,用异丙醇-乙酸乙酯(40：60)萃取,萃取液浓缩后,甲醇溶解残渣定容,采用高效液相色谱-紫外检测法(HPLC.UV)检测。1.4.2色谱条件色谱柱：Agilent C18柱(150mm×5mm,5μm)；流动相：甲醇：磷酸二氢钠(0.01mol/L,pH=5.5)=55:45(V:V)；柱温：25℃；流速：1.0ml/min;检测波长：301nm；进样量20μl。2济南市售动物性食品中兽药残留市场调查2.1样品采集方法2012年3月至5月,选择济南市区的五个行政区作为采样区域,每个行政区内,随机选取两个人口较集中的居民区,每个居民区周边随机选择居民常去购物的超市和农贸市场作为采样点。在超市和农贸市场里随机采购品牌和非品牌肉制品(品牌商标的界定参考中国肉业网-2011中国最受消费者喜爱的十大肉制品、十大猪肉、十大鸡肉、十大牛肉、十大羊肉品牌,上述之外的商标归为非品牌),每种动物性食品随机购买两份。2.2检测项目本研究拟检测10种兽药,分别是土霉素(OTC)、四环素(TC)、金霉素(CTC),磺胺嘧啶(SD)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺甲噁唑(SMZ),氧氟沙星(OFL)、环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(ENR),盐酸克伦特罗(CL)。2.3样品种类及数量每类兽药均检测272份动物性食品,其中猪肉各45份、猪肝各40份、猪肾各32份、鸡肉各41份、鸡肝各30份、鸡胗各34份、牛肉各40份、羊肉各10份。2.4数据处理与比较保留时间定性,标准曲线法求得样品中兽药残留的含量。所得值与农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》比较。2.5统计学分析采用SPSS18.0统计软件进行分析,数据之间的比较采用χ2检验,P<0.05认为有统计学意义。[结果]1动物性食品中四类兽药残留检测方法学研究1.1四环素类兽药残留检测方法1.1.1检测波长和保留时间三种TCs兽药在273nm处有较强的吸收峰。OTC.TC.CTC得到了较好的分离,峰形良好,左右对称。保留时间依次是OTC(5.81min).TC(7.10min). CTC(8.98min).1.1.2线性关系土霉素回归方程为Y=1.04×105X—4208.45,r=0.99977；四环素回归方程为Y=1.16x105X-2605.42,r=0.99998；金霉素回归方程为Y=5.61×104X-8848.75,r=0.99928；线性范围均为0.2-5.0μg/ml。1.1.3加标回收率和精密度三种不同加标浓度的土霉素,加标回收率为87.13%～95.33%、日内精密度(RSD日内)为2.71%-3.24%、日间精密度(RSD日间)为3.47%-4.79%；三种不同加标浓度的四环素,加标回收率为89.24%-102.62%、日内精密度(RSD日内)为2.33%～3.84%,日间精密度(RSD日间)为3.58%～4.54%；三种不同加标浓度的金霉素,加标回收率为91.51%-103.22%、日内精密度(RSD日内)为2.94%-3.28%、日间精密度(RSD日间)为3.80%-4.47%。1.1.4检测限土霉素检测限为3.44×10-3μg/ml；四环素检测限为3.67×10-3μg/ml；金霉素检测限为4.65×10-μg/ml.1.2磺胺类兽药残留检测方法1.2.1检测波长和保留时间三种SAs兽药在268nm处有较强的吸收峰。SD、SM2、SMZ得到了较好的分离,峰形良好。保留时间依次是SD(3.61min)、SM2(4.96min)、SMZ(9.32min)。1.2.2线性关系磺胺嘧啶回归方程为Y=2.27×105x+3239.58,r=0.99987；磺胺二甲基嘧啶回归方程为Y=1.85×105X+2144.72,r=0.99998；磺胺甲嗯唑回归方程为Y=2.35x105X+5519.98,r=0.99987；线性范围均为0.001～0.2gg/ml。1.2.3加标回收率和精密度三种不同加标浓度的磺胺嘧啶,加标回收率为97.14%-101.79%、日内精密度(RSD日内)为3.24%～4.70%、日间精密度(RSD日间)为2.89%～3.34%；三种不同加标浓度的磺胺二甲基嘧啶,加标回收率为95.49%-100.57%、日内精密度(RSD日内)为3.21%～3.83%、日间精密度(RSD日间)为2.93%-3.38%；三种不同加标浓度的磺胺甲噁唑,加标回收率为96.82%-101.84%、日内精密度(RSD日内)为3.03%-3.45%、日间精密度(RSD日间)为2.65%～3.08%。1.2.4检测限磺胺嘧啶检测限为7.12×10-4μg/ml;磺胺二甲嘧啶检测限为8.73×10-4μg/ml；磺胺甲嗯唑检测限为8.91×10-4μg/ml。1.3喹诺酮类兽药残留检测方法1.3.1检测波长和保留时间三种QNs兽药在279nnl处有较强的吸收峰。OFL、CIP、ENR得到了较好的分离,峰形尖锐,左右对称。保留时间依次为OFL(11.92min)、CIP(12.86min)、 ENR(16.21min)。1.3.2线性关系氧氟沙星回归方程为Y=2.62×105X-1353.21,r=0.99980；环丙沙星回归方程为Y=5.16×105X+87.15,r=0.99976；恩诺沙星回归方程为Y=1.32×106X一640.96,r=0.99963；线性范围均为0.01～0.2μg/ml。1.3.3加标回收率和精密度三种不同加标浓度的氧氟沙星,加标回收率为89.27%～99.95%、日内精密度(RSD日内)为2.98%～3.74%、日间精密度(RSD日间)为3.37%～4.90%；三种不同加标浓度的环丙沙星,加标回收率为88.32%～97.31%、日内精密度(RSD日内)为2.32%-3.15%、日间精密度(RSD日间)为3.53%～4.54%；三种不同加标浓度的恩诺沙星,加标回收率为89.51%-101.52%、日内精密度(RSD日内)为2.77%～3.23%、日间精密度(RSD日间)为3.72%～4.37%。1.3.4检测限氧氟沙星检测限为2.71×10-3μg/ml,环丙沙星检测限为1.39×10-3μg/ml,恩诺沙星检测限为6.52×10-4μg/ml。1.4盐酸克伦特罗兽药残留检测方法1.4.1检测波长和保留时间CL在301nm处有较强的吸收峰。CL与杂峰得到了较好的分离,峰形良好。保留时间为6.52min。1.4.2线性关系盐酸克伦特罗回归方程为Y=3.43×104X—1084.70,r=0.99984；线性范围为0.2～10.0μg/ml。1.4.3加标回收率和精密度三种不同加标浓度的盐酸克伦特罗,加标回收率为92.86%～100.93%、日内精密度(RSD日间)为3.34%～3.70%、日间精密度(RSD日间)为3.76%～4.03%。1.4.4检测限盐酸克伦特罗检测限为4.83×10-4μg/ml.2济南市售动物性食品中兽药残留监测结果2.1.四环素类兽药残留情况2.1.1动物性食品中三种TCs兽药残留超标率及残留超标值范围272份动物性食品中,CTC残留超标率最高,为31.25%,超标残留值范围为512.50～1747258.73μg/kg；TC残留超标率为26.10%,超标残留值范围为169.72～271833.91μg/kg；OTC残留超标率为24.26%,超标残留值范围为118.88～60139.67μg/kg.8种动物性食品中都不同程度的检出了三种TCs兽药,其中肝、肾超标率较高。鸡胗中TC超标残留值范围为327.44～30626.39μg/kg,P75的超标残留值为11777.87μg/kg；鸡胗中CTC超标残留值范围为1668.62～476600.78μg/kg,P75的超标残留值为29262.18μg/kg；鸡肝中OTC超标残留值范围为329.95～60139.67μg/kg,P75的超标残留值为49802.84μg/kg；猪肉中CTC超标残留值范围为512.50～23291.80μg/kg,P75的超标残留值为18116.10μg/kg；牛肉中CTC超标残留值范围为1155.07-1747258.73μg/kg,P75的超标残留值为150514.92μg/kg；超标残留值范围较宽,残留超标值较高,超标严重。其余动物性食品中三种TCs兽药残留超标值范围也较宽,但大部分样品残留值均集中在较小的范围内,超标值相对较低。2.1.2不同采样点各动物性食品三种TCs兽药残留超标情况检测TCs类兽药所购得的动物性食品,超市采样为128份,农贸市场采样144份。超市出售的羊肉TC超标率为0,农贸市场出售的羊肉TC、OTC、CTC超标率均为O。超市出售的牛肉TC超标率高于农贸市场出售的牛肉TC超标率,经统计学分析,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.1.3品牌与非品牌动物性食品三种TCs兽药残留超标情况272份动物性食品中,购得品牌动物性食品为107份,购得非品牌动物性食品为165份,品牌和非品牌动物性食品中三种TCs兽药残留超标率均较高。非品牌牛肉中TC超标率低于品牌牛肉,差异具有统计学意义(P<0.05)；非品牌牛肉中CTC超标率低于品牌牛肉,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.2磺胺类兽药残留情况2.2.1动物性食品中三种SAs兽药残留超标率及残留超标值范围272份动物性食品中,SD残留超标率最高,为43.38%,超标残留值范围为103.22～37430.31μg/kg;SM2残留超标率为20.96%,超标残留值范围为125.35-67420.41μg/kg;SMZ残留超标率为19.85%,超标残留值范围为109.95-32538.85μg/kgo10份羊肉中,SD和SMZ的超标率均为0,其中的2份羊肉SM2超标。其余7种动物性食品中都不同程度的检出了三种磺胺类兽药,肝、肾超标率较高,且此7种动物性食品中SD的超标率均高于SM2和SMZ。鸡肝中SM2超标残留值范围为127.08～26078.25μg/kg,P75的超标残留值为10722.13μg/kg;牛肉中SMZ超标残留值范围为109.95～32538.85μg/kg,P75的超标残留值为22886.44μg/kg;此两种动物性食品超标残留值范围较宽,超标残留值较高。猪肝中SM2超标残留值范围为162.83～19401.09μg/kg,P75的超标残留值为2294.08μg/kg;鸡肝中SD超标残留值范围为117.68～37430.31μg/kg,P75的超标残留值为2515.52～μg/kg;牛肉中SM2超标残留值范围为146.35～67420.41μg/kg,P75的超标残留值为2556.25μg/kg;三者超标值范围虽也较宽,但大部分样品残留值相对较低。其余动物性食品残留超标值范围较小,超标值相对较低。2.2.2不同采样点各动物性食品中三种SAs兽药残留超标情况检测SAs类兽药所购得的动物性食品,超市采样为128份,农贸市场采样144份。超市出售的猪肉SM2超标率为0,超市出售的鸡肉SMZ超标率为0,超市出售的羊肉SD、SM2、SMZ超标率均为0,农贸市场出售的羊肉SD、SMZ超标率为O。超市出售的猪肝SM2超标率低于农贸市场出售的猪肝SM2超标率,差异具有统计学意义(P<0.05)；超市出售的鸡肝SMZ超标率高于农贸市场出售的鸡肝SMZ超标率,差异具有统计学意义(P<0.05)；超市出售的鸡胗SD超标率低于农贸市场出售的鸡胗SD超标率,差异具有统计学意义(P<0.05)；超市出售的鸡胗SM2超标率高于农贸市场出售的鸡胗SM2超标率,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.2.3品牌与非品牌动物性食品中三种SAs兽药残留超标情况272份动物性食品中,品牌动物性食品为107份,非品牌动物性食品为165份。品牌猪肉、猪肾、鸡肉的SM2超标率为0；品牌牛肉中SM2的超标率为100%；非品牌羊肉中SD、SMZ残留超标率为O。品牌猪肝中SM2、SMZ超标率低于非品牌猪肝中SM2、SMZ超标率,差异有统计学意义(P<0.05)；品牌猪肾中SD、SM2超标率低于非品牌猪肾中SD、SM2超标率,差异有统计学意义(P<0.05)；品牌牛肉中SM2、SMZ超标率高于非品牌牛肉中SM2、SMZ超标率,差异有统计学意义(P<0.05)。2.3喹诺酮类兽药残留情况2.3.1动物性食品中三种QNs兽药残留超标率及残留超标值范围272份动物性食品中,CIP残留超标率最高,为17.28%,超标残留值范围为103.18～5517.76μg/kg；其次是OFL,超标率为16.18%,超标残留值范围为136.37～7246.79μg/kg；ENR超标率最低,为4.04%,超标残留值范围为122.65～8820.62μg/kg；10份羊肉中,CIP的超标率为0,2份羊肉OFL超标,1份羊肉ENR超标；猪肉、鸡肝和鸡胗中ENR超标率均为0；其余动物性食品中都不同程度的检出了三种QNs兽药,其中肝、肾超标率较高；8种动物性食品中ENR检出率较低,均在10%以下。猪肉中CIP超标残留值范围为105.63～5517.76μg/kg,P75的超标残留值为4226.86μg/kg；鸡胗中OFL超标残留值范围为888.12～26134.75μg/kg,P75的超标残留值为25568.66μg/kg；牛肉中OFL超标残留值范围为1313.68～7246.79μg/kg,P75的超标残留值为6527.27μg/kg；羊肉中ENR超标残留值为8820.62μg/kg；此四者超标残留值范围较宽,超标残留值较高。上述之外的其余动物性食品中残留超标值范围较小,超标值相对较小。2.3.2不同采样点各动物性食品中三种QNs兽药残留超标情况检测QNs兽药所购得的动物性食品,超市采样为128份,农贸市场采样144份。超市出售的猪肉、猪肝、鸡肝、鸡胗中ENR的超标率为0；超市出售的羊肉中OFL、CIP超标率为0；农贸市场出售的猪肉、鸡肉、鸡肝、鸡胗中ENR超标率为0,农贸市场出售的羊肉中CIP、ENR超标率为O。超市出售的猪肝中ENR超标率低于农贸市场出售猪肝中ENR超标率,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.3.3品牌与非品牌动物性食品中三种QNs兽药残留超标情况272份动物性食品中,品牌动物性食品为107份,非品牌动物性食品为165份。品牌猪肉、猪肝、猪肾、鸡肉、鸡胗中ENR超标率为0；品牌鸡肝中OFL、CIP、ENR超标率均为0；非品牌猪肉、鸡肝、鸡胗中ENR超标率为0；非品牌羊肉中CIP残留超标率为0。品牌猪肝中ENR超标率低于非品牌肝中ENR超标率,差异有统计学意义(P<0.05)；品牌牛肉中OFL、CIP超标率高于非品牌牛肉中OFL、CIP超标率,差异有统计学意义(P<0.05)。2.4盐酸克伦特罗兽药残留情况272份动物性食品中,CL超标率为10.29%,超标率较高,超标残留值范围为4626.18-119875.70μg/kg。羊肉中没有检测出CL,猪肾中CL兽药残留超标率最高,为21.88%,其次为鸡肉,超标率为17.07%；猪肝和鸡胗中CL兽药残留超标率也较高,分别为10%和11.76%；牛肉中检测出了CL,超标率为5%。农贸市场出售的猪肾、鸡肉中CL残留检出率较高,分别为22.22%和28.57%,高于超市出售的猪肾和鸡肉；超市出售的猪肝、鸡胗CL残留检出率较高,分别为15%和16.67%,高于农贸市场出售的猪肝和鸡胗。虽动物性食品中CL超标率较低,但除羊肉之外的动物性食品中残留值均较高,猪肝中CL超标残留值范围为12397.12-119875.70μg/kg,P75的超标残留值为95657.76μg/kg;猪肾中CL超标残留值范围为4671.87-36707.76μg/kg,P75的超标残留值为14063.09μg/kg；鸡肉中CL超标残留值范围为4355.12-32959.84μg/kg,P75的超标残留值为32224.39μg/kg;鸡肝中CL超标残留值范围为21617.85～58741.04μg/kg;鸡胗中CL超标残留值范围为4736.72～8123.56P75的超标残留值为22448.91[结论]1建立的分别检测TCs、SAs、QNs、CL四类兽药的四种高效液相色谱法适合动物性食品的快速、灵敏、准确、批量检测。2市售动物性食品中10种兽药的超标率较高,超标率最高的兽药是磺胺嘧啶(SD),超标率为43.38%；超标率最低的兽药是恩诺沙星(ENR),超标率为4.04%；CL是禁止检出的兽药,其检出率为10.29%。38种动物性食品中,羊肉中兽药残留的超标率相对较小,超标残留值相对较低；其余7种动物性食品中兽药残留的超标率较高,残留量较大；其中,肝、肾、鸡胗器官超标现象严重。4超市出售的动物性食品和农贸市场的比较,同种动物性食品同一兽药残留超标率高低无明显规律,大多数动物性食品中同一种兽药残留超标率无统计学差异；品牌动物性食品和非品牌的动物性食品比较,同种动物性食品同一兽药残留超标率高低亦无明显规律,大多数动物性食品中同一种兽药残留超标率无统计学差异。5济南市区市售动物性食品中兽药残留现状不容乐观,居民经常食用的动物性食品存在着不同程度的安全问题。