杂色曲霉素(sterigmatocystin, ST)是杂色曲霉、构巢曲霉等曲霉菌属真菌所产生的一种低分子量代谢产物,广泛存在于自然界,是动物和人类食物中最常见的污染物之一。研究表明ST具有致癌性,可诱导不同的实验动物发生肝癌、肺癌、间皮瘤等肿瘤。ST还具有遗传毒性,可直接损伤细胞DNA、与DNA形成加合物,引起基因突变。本研究室前期实验发现,ST可诱发体外培养人胚胃黏膜细胞发生恶性转化以及抑癌基因P53的突变、过表达;长期灌胃ST可以引起小鼠腺胃黏膜的肠上皮化生和腺上皮不典型增生。细胞周期调控是细胞最重要的生物学过程之一,细胞周期的紊乱可导致细胞的癌变。研究证明ST可以影响靶细胞的细胞周期,谢同欣等研究发现,ST可诱导小鼠胚胎纤维母细胞细胞周期发生G2/M期阻滞。本研究室近期实验也证实,ST可以诱导体外培养胃黏膜上皮细胞GES-1细胞周期阻滞在G2期。但ST诱导细胞G2期阻滞的可能机制还不明确。cyclins是细胞周期进程调控的关键因子,可以激活它们的结合蛋白——细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDKs),进而靶向作用于各自的下游蛋白。CDK通过调节靶蛋白特定位点的磷酸化,介导细胞周期通过周期调控点。有丝分裂激酶Cdc2 (Cdk1)的激活是G2期调控点的重要的调控因素,它也受到多种因素的调控,例如与CyclinB的周期性结合、可逆的磷酸化作用和胞内移位等。细胞周期蛋白B1 (CyclinB1)是细胞周期G2期的周期蛋白,与其激酶Cdc2形成的复合物是启动有丝分裂的关键因子,可促使细胞周期由G2期进入M期。CyclinB1蛋白表达在G2期达到高峰,与Cdk1形成复合物,进入细胞核,此过程也受到磷酸化作用的调节。蛋白磷酸酶Cdc25C能够使Cdc2去磷酸化,从而促进细胞周期的进程;而磷酸化Cdc25C可丧失酶活性,引起Cdc2磷酸化程度增高,进而导致细胞周期阻滞在G2期。eIF4E是蛋白质合成的重要调节因子,可与其结合蛋白4E-BP1结合,调节细胞周期蛋白D1 (CyclinD1)等蛋白质的合成,eIF4E磷酸化水平增高可增强其促进蛋白质合成的作用。研究表明,eIF4E和4E-BP1也与细胞周期紊乱有关,在多种恶性肿瘤中表达异常。本研究室近期实验发现,ST不仅可以抑制胃黏膜上皮细胞(GES-1)增殖,诱导GES-1细胞周期发生G2期阻滞,还可以影响G2期调控点关键因子——CyclinB1的表达以及Cdc2激酶和Cdc25C磷酸酶的活性,同时,ST还可以抑制eIF4E的翻译起始功能。JNK、ERK和p38是MAPK信号转导通路中最重要的成员。霉菌毒素等环境致癌物、化疗药物等多种体内外因素均可通过影响JNK、ERK和p38信号转导通路诱导靶细胞内相关基因表达,进而引起机体和细胞的相应生物学性状变化。PI3K是Her2家族重要信号转导通路之一,可通过调节下游核因子mTOR进而调控细胞增殖及蛋白质的合成,并且与肿瘤的侵袭、转移、预后及化疗耐受有关。为进一步探讨ST诱导体外培养人胃粘膜上皮细胞周期阻滞的可能机制。本研究在前期实验研究的基础上,观察了不同浓度ST对体外培养永生化胃粘膜上皮细胞GES-1中JNK、ERK、p38和PI3K信号转导通路的影响情况,同时探讨了JNK、ERK和PI3K信号转导通路的激活在ST诱导的GES-1细胞周期G2期阻滞中的作用。本研究论文共分为三个部分:1杂色曲霉素对GES-1细胞中MAPK和PI3K信号转导通路的影响研究目的:探讨一次性给予不同浓度ST对体外培养胃黏膜上皮细胞GES-1中JNK、ERK、p38和PI3K/mTOR信号转导通路的影响情况。方法:取对数生长期GES-1细胞,随机分为6组:溶剂对照组和对照组分别给予DMSO (0.2 ml/L)和生理盐水处理。实验组给予DMSO溶解并以生理盐水稀释的ST,使其终浓度分别为100、500、1000、2000μg/L,处理24 h后,采用Western blot和RT-PCR方法检测GES-1中JNK/p-JNK、ERK/p-ERK、p38/p-p38和PI3K/mTOR/p-mTOR表达的变化情况。另取对数生长期GES-1细胞,分别给予1μM SP600125 (JNK信号通路特异性阻断剂)、50μM PD98059 (ERK信号通路特异性阻断剂)、0.5μM SB203580 (p38信号通路特异性阻断剂)和1μM LY-294002 (PI3K特异性阻断剂)预处理。实验分为5组,即对照组、溶剂对照组、ST处理组、阻断剂组和阻断剂+ST处理组。细胞培养24 h后,更换2%低血清DMEM培养基。阻断剂组分别加入SP600125 (1μM)、PD98059 (50μM)、SB203580 (0.5μM)和LY-294002(1μM)。30 min后ST处理组和阻断剂+ST处理组分别给予1000μg/L ST,溶剂对照组和对照组分别给予DMSO (0.1ml/L)和生理盐水处理。细胞处理24 h后离心收细胞,采用Western blot方法检测目的基因在蛋白水平上表达变化。结果:1.1 ST对JNK信号转导通路的影响1.1.1不同浓度ST对JNK信号转导通路的影响Western blot结果显示,ST 100、500、1000、2000μg/L处理后细胞内JNK蛋白相对表达量与溶剂对照组比较差异无显著性(P>0.05)。而ST 500、1000、2000μg/L处理后JNK磷酸化水平明显高于溶剂对照组(P<0.05),并且,在0～2000μg/L ST浓度范围内,JNK磷酸化水平与ST的处理浓度有明显剂量依赖关系(r=0.925, P<0.01, n=3)。RT-PCR方法检测发现,各ST处理组JNK mRNA相对表达量与溶剂对照组(P>0.05)相比,没有明显差别。1.1.2 SP600125预处理对ST作用后GES-1细胞JNK磷酸化水平的影响Western blot方法检测结果表明,SP600125组细胞JNK磷酸化水平明显低于溶剂对照组(P<0.05),SP600125预处理+ST处理组JNK磷酸化水平较ST单独处理组明显降低,但仍高于溶剂对照组(P<0.05),表明给予JNK阻断剂SP600125对JNK蛋白激酶具有特异阻断作用,但只能部分阻断ST对JNK信号转导通路的激活作用。1.2 ST对ERK信号转导通路的影响1.2.1不同浓度ST对ERK信号转导通路的影响Western blot结果显示,各ST处理组细胞ERK蛋白相对表达量与溶剂对照组比较无明显差异(P>0.05)。而ST 500、1000、2000μg/L处理后细胞内ERK磷酸化水平明显高于溶剂对照组(P<0.05),并且,在0～2000μg/L ST浓度范围内,ERK磷酸化水平与ST的处理浓度有明显剂量依赖关系(r=0.887, P<0.01, n=3)。RT-PCR方法检测发现,各ST处理组细胞中ERK mRNA相对表达量与溶剂对照组相比,没有明显差别(P>0.05)。1.2.2 PD98059预处理对ST作用后GES-1细胞ERK磷酸化水平的影响Western blot方法检测,结果表明PD98059组细胞ERK磷酸化水平明显低于溶剂对照组(P<0.05),给予PD98059预处理后,PD98059+ST处理组ERK的磷酸化水平较ST单独处理组明显降低,但仍高于溶剂对照组(P<0.05)。表明给予ERK阻断剂PD98059对ERK蛋白激酶具有特异阻断作用,但只能部分阻断ST对ERK信号转导通路的激活作用。1.3 ST对p38信号转导通路的影响1.3.1不同浓度ST对p38信号转导通路的影响Western blot结果显示,在0～2000μg/L ST浓度范围内,不同浓度ST处理后p38蛋白相对表达量与溶剂对照组比较均无明显差异(P>0.05)。ST 500、1000、2000μg/L处理后相对p38磷酸化水平明显低于溶剂对照组(P<0.05),并且,在0～2000μg/L ST浓度范围内,p38磷酸化水平与ST的处理浓度呈明显负相关关系(r=-0.843, P<0.01, n=3)。RT-PCR方法检测发现,各ST处理组细胞内p38 mRNA相对表达量与溶剂对照组相比,均没有明显差别(P>0.05)。1.3.2 SB203580预处理对ST作用后GES-1细胞p38磷酸化水平的影响Western blot检测结果表明,SB203580处理组细胞相对p38磷酸化水平均明显低于溶剂对照组(P<0.05),SP600125+ST处理组p38磷酸化水平较ST单独处理组明显降低(P<0.05),表明p38阻断剂SB203580对p38的磷酸化水平具有特异阻断作用,给予p38特异性阻断剂SB203580预处理,对ST诱导细胞p38磷酸化水平降低有明显的协同作用。1.4 ST对PI3K/mTOR信号转导通路的影响1.4.1不同浓度ST对PI3K/mTOR信号转导通路的影响Western blot结果显示,各ST处理组细胞PI3K蛋白相对表达量与溶剂对照组相比没有明显差异(P>0.05)。1000、2000μg/L ST处理组细胞mTOR蛋白相对表达量明显高于溶剂对照组(P<0.05),并且在0～2000μg/L ST浓度范围内,mTOR的蛋白表达与ST的处理浓度有明显剂量依赖关系(r=0.831, P<0.01, n=3)。同时,ST也可剂量依赖性地上调mTOR的磷酸化水平(r=0.868, P<0.01, n=3),其中500、1000和2000μg/L ST处理组mTOR的磷酸化水平升高更明显(P<0.05)。RT-PCR方法检测结果发现,与溶剂对照组相比,不同浓度ST处理24 h对细胞内PI3K mRNA相对表达量没有明显影响(P>0.05),但可以明显上调mTOR在mRNA水平上的表达,mTOR mRNA的相对表达量与ST的处理浓度呈明显正相关关系(r=0.831, P<0.01, n=3)。1.4.2 LY-294002预处理对ST作用后GES-1细胞mTOR基因表达及其磷酸化水平的影响Western blot方法检测,LY-294002组细胞mTOR及其磷酸化水平与溶剂对照组相比没有明显差别(P>0.05),LY-294002+ST处理组mTOR磷酸化水平较ST单独处理组明显降低(P<0.05),与溶剂对照组相比没有明显差别(P>0.05);而mTOR蛋白的表达则明显高于溶剂对照组(P<0.05),与ST单独处理组没有差别(P>0.05)。RT-PCR结果显示,LY-294002组细胞mTOR mRNA相对表达量与溶剂对照组相比没有明显差别(P>0.05),LY-294002+ST处理组mTOR mRNA相对表达量明显高于溶剂对照组(P<0.05),而与ST单独处理组相比没有明显差别(P>0.05)。结果表明,给予PI3K阻断剂LY-294002对PI3K/mTOR信号转导通路具有特异阻断作用,可以阻断ST诱导mTOR磷酸化水平升高的作用,但对mTOR在蛋白和mRNA水平上的表达没有明显影响。2 JNK、ERK和PI3K信号转导通路的激活在杂色曲霉素诱导GES-1细胞G2期阻滞中的作用研究目的:探讨JNK、ERK和PI3K信号转导通路特异性阻断剂预处理对ST处理24 h诱导体外培养GES-1细胞增殖抑制、G2期阻滞及其相关因子表达的影响。方法:取对数生长期GES-1细胞,分别给予1μM SP600125 (JNK信号通路特异性阻断剂)、50μM PD98059 (ERK信号通路特异性阻断剂)和1μM LY-294002 (PI3K特异性阻断剂)预处理细胞。按1×104个/L接种于96孔板,待细胞进入对数生长期后更换培养基,实验分为5组,即对照组、溶剂对照组、ST处理组、阻断剂组和阻断剂+ST处理组。每孔终体积为200μl,同时设空白对照孔、对照孔和溶剂对照孔,细胞培养24 h后,更换2%低血清DMEM培养基,阻断剂组分别加入SP600125 (1μM)、PD98059 (50μM)和LY-294002 (1μM)。30 min后ST处理组和阻断剂+ST处理组分别给予1000μg/L ST,溶剂对照组和对照组分别给予DMSO (0.1ml/L)和生理盐水处理。细胞处理24 h后,采用MTT检测细胞存活率。另取对数生长期GES-1细胞,分为5组,即对照组、溶剂对照组、ST处理组、阻断剂组和阻断剂+ST处理组(处理同上)。细胞处理24 h后离心收细胞,采用FCM检测细胞周期分布情况,采用Western blot和RT-PCR方法观察周期调控关键因子——CyclinB1蛋白的表达、Cdc2激酶和Cdc25C磷酸酶活性的变化情况。结果:2.1 JNK信号转导通路在ST诱导GES-1细胞G2期阻滞中的作用2.1.1 SP600125预处理对ST诱导的GES-1细胞存活率降低的影响MTT结果表明,SP600125+ST组细胞存活率明显高于ST单独处理组(P<0.05),但仍明显低于溶剂对照组(P<0.05)。表明SP600125预处理可部分阻断ST对GES-1细胞增殖的抑制作用。2.1.2 SP600125预处理对ST诱导的GES-1细胞G2期阻滞的影响FCM检测结果显示,与ST 1 000μg/L处理组相比,SP600125预处理+ST 1000μg/L处理组G0/G1期所占比例明显升高;而G2/M期细胞比例则明显降低(P<0.05),但仍明显高于溶剂对照组(P<0.05)。表明SP600125预处理可部分阻断ST诱导的细胞G2/M期比例增高作用。2.1.3 SP600125预处理对ST作用后GES-1细胞G2期相关因子的影响2.1.3.1 SP600125预处理对CyclinB1表达的影响Western blot检测结果显示,SP600125预处理+ST 1000μg/L处理组CyclinB1蛋白的表达明显低于溶剂对照组,同时显著低于ST 1000μg/L处理组(P<0.05)。RT-PCR结果发现,SP600125预处理+ST组细胞内CyclinB1 mRNA的表达明显低于ST 1000μg/L处理组(P<0.05),而与溶剂对照组相比没有差别。表明SP600125预处理可阻断ST对GES-1细胞内CyclinB1在蛋白和mRNA水平表达的升高作用。2.1.3.2 SP600125预处理对Cdc2激酶的影响Western blot检测结果显示,与ST 1000μg/L处理组细胞相比,SP600125预处理+ST 1000μg/L处理组内Cdc2的去磷酸化水平明显升高,同时其磷酸化水平明显降低(P<0.05),而与溶剂对照组相比无明显差别。RT-PCR结果表明,SP600125预处理+ST组细胞内Cdc2 mRNA的表达与ST 1000μg/L处理组相比没有明显差别(P>0.05)。表明SP600125预处理可阻断ST对GES-1细胞内Cdc2去磷酸化水平和Cdc2磷酸化水平的影响,但对Cdc2 mRNA没有明显影响。2.1.3.3 SP600125预处理对Cdc25C磷酸酶的影响Western blot检测结果显示,与溶剂对照组相比,SP600125预处理+ST 1000μg/L处理组内Cdc25C蛋白的表达明显升高,同时明显高于ST 1000μg/L处理组;而Cdc25C磷酸化水平则较ST 1000μg/L处理组明显降低(P<0.05),与溶剂对照组相比没有明显差别。RT-PCR结果表明,SP600125预处理+ST组细胞Cdc25C mRNA的表达与ST 1000μg/L处理组相比没有明显差别(P>0.05)。表明SP600125预处理可阻断ST对GES-1细胞内Cdc25C的蛋白表达和Cdc25C磷酸化水平的影响,但对Cdc25C mRNA没有明显影响。2.2 ERK信号转导通路在ST诱导GES-1细胞G2期阻滞中的作用2.2.1 PD98059预处理对ST诱导的GES-1细胞存活率降低的影响MTT结果表明,PD98059+ST处理组细胞存活明显高于ST单独处理组(P<0.05),而与溶剂对照组相比没有明显差别(P>0.05)。表明PD98059预处理可以阻断ST对GES-1细胞的增殖抑制作用。2.2.2 PD98059预处理对ST诱导的GES-1细胞G2期阻滞的影响FCM检测结果显示,与ST 1000μg/L处理组相比,PD98029预处理+ ST 1000μg/L处理组S期细胞比例明显升高(P<0.05);而G2/M期细胞比例明显降低(P<0.05),但仍明显高于溶剂对照组(P<0.05)。表明PD98059预处理可部分阻断ST诱导的细胞G2/M期比例增高。2.2.3 PD98059预处理对ST作用后GES-1细胞G2期相关因子的影响2.2.3.1 PD98059预处理对CyclinB1表达的影响Western blot检测结果显示,PD98059预处理+ST 1000μg/L处理组CyclinB1的蛋白表达与ST 1000μg/L处理组相比显著降低(P<0.05),但仍明显高于溶剂对照组(P<0.05)。RT-PCR结果显示,PD98059预处理+ST组细胞内CyclinB1 mRNA的表达与ST 1000μg/L处理组相比没有明显差别(P>0.05)。表明PD98059预处理可部分阻断ST对GES-1细胞内CyclinB1蛋白表达的升高作用,但对CyclinB1 mRNA没有明显影响。2.2.3.2 PD98059预处理对Cdc2激酶的影响Western blot检测结果显示,PD98059预处理+ST 1000μg/L处理组细胞内Cdc2的去磷酸化水平与ST 1000μg/L处理组相比,没有明显差异(P>0.05);而其磷酸化水平则明显低于ST 1000μg/L处理组(P<0.05),与溶剂对照组相比没有明显差异(P>0.05)。RT-PCR结果显示,PD98059预处理+ST组细胞Cdc2 mRNA的表达明显低于ST 1000μg/L处理组,但仍高于溶剂对照组(P<0.05)。表明PD98059预处理可阻断ST对GES-1细胞内Cdc2磷酸化水平的升高作用,同时部分阻断ST对Cdc2 mRNA表达的升高作用。2.2.3.3 PD98059预处理对Cdc25C磷酸酶的影响Western blot检测结果显示,PD98059预处理+ST 1000μg/L处理组细胞Cdc25C蛋白表达与ST 1000μg/L处理组相比没有明显差异(P>0.05);Cdc25C磷酸化水平则较ST 1000μg/L处理组明显降低,但仍高于溶剂对照组(P<0.05)。RT-PCR结果显示,PD98059预处理+ST组细胞内Cdc25C mRNA的表达与ST 1000μg/L处理组相比没有明显差别(P>0.05)。提示PD98059预处理可部分阻断ST对细胞内Cdc25C磷酸化水平的升高作用,但对Cdc25C mRNA没有明显影响。2.3 PI3K信号转导通路在ST诱导GES-1细胞G2期阻滞中的作用2.3.1 LY-294002预处理对ST诱导的GES-1细胞存活率降低的影响MTT结果表明,LY-294002+ST处理组细胞存活率明显低于溶剂对照组(P<0.05),而与ST单独阻断剂组相比没有明显差别(P>0.05)。表明LY-294002预处理对ST诱导的GES-1细胞增殖抑制作用没有明显影响。2.3.2 LY-294002预处理对ST诱导的GES-1细胞G2期阻滞的影响FCM检测结果显示,LY-294002预处理+ST 1000μg/L处理组G0/G1期和S期细胞所占比例均较ST 1000μg/L处理组明显降低,而G2/M期细胞比例则明显增加(P<0.05),表明LY-294002预处理对ST诱导的细胞G2/M期比例增高具有协同作用。2.3.3 LY-294002预处理对ST作用后GES-1细胞G2期相关因子的影响2.3.3.1 LY-294002预处理对CyclinB1表达的影响Western blot检测结果显示,LY-294002预处理+ST 1000μg/L处理组CyclinB1蛋白的表达与ST 1000μg/L处理组相比显著降低,较溶剂对照组也明显降低(P<0.05)。RT-PCR结果显示,LY-294002预处理+ST组细胞内CyclinB1 mRNA的表达明显低于ST单独处理组,同时明显低于溶剂对照组(P<0.05)。表明LY-294002预处理可阻断ST诱导GES-1细胞内CyclinB1在蛋白和mRNA水平表达的升高作用。2.3.3.2 LY-294002预处理对Cdc2激酶的影响Western blot检测结果显示,LY-294002预处理+ST 1000μg/L处理组细胞内Cdc2的去磷酸化水平与ST 1000μg/L处理组相比没有明显差异(P>0.05);而其磷酸化水平则明显高于ST 1000μg/L处理组(P<0.05),同时明显高于溶剂对照组(P<0.05)。RT-PCR结果显示,LY-294002预处理+ST组细胞Cdc2 mRNA的表达明显高于溶剂对照组,同时也明显高于ST单独处理组(P<0.05)。表明LY-294002预处理对ST诱导的GES-1细胞内Cdc2的磷酸化水平及其mRNA表达升高有明显的协同作用。2.3.3.3 LY-294002预处理对Cdc25C磷酸酶的影响Western blot检测结果显示,LY-294002预处理+ST 1000μg/L处理组细胞内Cdc25C蛋白的表达与ST 1000μg/L处理组相比没有明显差异(P>0.05);而其磷酸化水平则较ST 1000μg/L处理组明显升高(P<0.05),同时也明显高于溶剂对照组(P<0.05)。RT-PCR结果显示,LY-294002预处理+ST组细胞内Cdc25C mRNA的表达与ST 1000μg/L处理组相比没有明显差别(P>0.05)。表明LY-294002预处理对ST诱导的GES-1细胞内Cdc25C磷酸化水平升高有明显的协同作用,但对Cdc25C在蛋白和mRNA水平上的表达没有明显影响。3 JNK、ERK和PI3K信号转导通路的激活在杂色曲霉素影响GES-1细胞蛋白质合成起始因子表达的作用研究目的:进一步探讨JNK、ERK和PI3K信号转导通路特异性阻断剂预处理,对ST处理24 h诱导体外培养GES-1细胞蛋白质合成障碍的影响。方法:实验细胞处理、分组(同前)。继续采用Western blot和RT-PCR方法研究了分别给予JNK、ERK和PI3K信号转导通路特异性阻断剂预处理,ST诱导的体外培养胃黏膜上皮细胞GES-1细胞中eIF4E和4E-BP1的表达及其活性变化,以及CyclinD1蛋白表达的变化情况结果:3.1 JNK信号转导通路在ST影响GES-1细胞蛋白质合成中的作用3.1.1 SP600125预处理对eIF4E表达的影响Western blot检测结果显示,SP600125预处理+ST 1000μg/L处理组细胞内eIF4E蛋白的表达与溶剂对照组相比明显下降,同时显著低于ST单独处理组(P<0.05),而eIF4E磷酸化水平则明显高于溶剂对照组,同时显著高于ST单独处理组(P<0.05)。RT-PCR结果表明,SP600125预处理+ST组细胞内eIF4E mRNA的表达明显低于ST 1000μg/L处理组,但仍明显高于溶剂对照组(P<0.05)。表明SP600125预处理可阻断ST对GES-1细胞内eIF4E的活性抑制作用,同时可部分阻断ST对eIF4E mRNA表达的升高作用。3.1.2 SP600125预处理对4E-BP1表达的影响Western blot检测结果显示,SP600125预处理+ST 1000μg/L处理组4E-BP1蛋白的表达明显低于ST单独处理组(P<0.05),而与溶剂对照组相比没有明显变化(P>0.05);4E-BP1磷酸化水平较溶剂对照组明显升高,同时显著高于ST单独处理组(P<0.05)。RT-PCR结果表明,SP600125预处理+ST组细胞内4E-BP1 mRNA的表达也明显低于ST单独处理组,但仍明显高于溶剂对照组(P<0.05)。表明SP600125预处理可阻断ST对GES-1细胞内4E-BP1活性的促进作用,同时可部分阻断ST对4E-BP1 mRNA表达的升高作用。3.1.3 SP600125预处理对CyclinD1蛋白表达的影响SP600125预处理+ST 1000μg/L处理组CyclinD1蛋白的表达明显高于ST单独处理组,但仍明显低于溶剂对照组(P<0.05),表明SP600125预处理可部分阻断ST对GES-1细胞内CyclinD1蛋白表达的降低作用。3.2 ERK信号转导通路在ST影响GES-1细胞蛋白质合成中的作用3.2.1 PD98059预处理对eIF4E表达的影响Western blot检测结果显示,PD98059预处理+ST 1000μg/L处理组内eIF4E蛋白的表达与ST 1000μg/L处理组相比没有明显差异(P>0.05),而其磷酸化水平与ST 1000μg/L处理组细胞相比明显升高(P<0.05),而与溶剂对照组没有明显差别(P>0.05)。RT-PCR结果表明,PD98059预处理+ST组细胞内eIF4E mRNA的表达明显低于ST单独处理组(P<0.05),而与溶剂对照组相比没有差别。表明PD98059预处理对ST诱导的GES-1细胞内eIF4E蛋白的表达增高没有影响;但可阻断ST对eIF4E磷酸化水平的降低以及eIF4E mRNA表达的升高作用。3.2.2 PD98059预处理对4E-BP1的影响Western blot检测结果显示,PD98059预处理+ST 1000μg/L处理组4E-BP1蛋白的表达较ST单独处理组明显降低(P<0.05),而与溶剂对照组相比没有明显差别;4E-BP1磷酸化水平与ST 1000μg/L处理组细胞相比也明显升高(P<0.05),也与溶剂对照组相比没有明显差别(P>0.05)。RT-PCR结果表明,PD98059预处理+ST组细胞4E-BP1 mRNA的表达与ST单独处理组相比明显降低,但仍明显高于溶剂对照组(P<0.05)。表明PD98059预处理可阻断ST对GES-1细胞内4E-BP1蛋白的表达升高作用及4E-BP1磷酸化水平降低作用;同时可部分阻断4E-BP1 mRNA表达升高的作用。3.2.3 PD98059预处理对CyclinD1蛋白表达的影响PD98059预处理+ST 1000μg/L处理组CyclinD1蛋白的表达明显高于溶剂对照组(P<0.05),同时显著高于ST 1000μg/L处理组(P<0.05),表明PD98059预处理可阻断ST诱导GES-1细胞内CyclinD1蛋白表达降低的作用。3.3 PI3K信号转导通路在ST影响GES-1细胞蛋白质合成中的作用3.3.1 LY-294002预处理对eIF4E表达的影响Western blot检测结果显示,LY-294002预处理+ST 1000μg/L处理组内eIF4E蛋白的表达明显高于溶剂对照组,同时明显高于ST单独处理组(P<0.05);eIF4E的磷酸化水平较ST处理组明显降低(P<0.05),同时明显低于溶剂对照组(P<0.05)。RT-PCR结果表明,LY-294002预处理+ST组细胞内eIF4E mRNA的表达明显高于溶剂对照组,并且也较ST单独处理组明显升高(P<0.05)。表明LY-294002预处理对ST诱导的eIF4E在蛋白和mRNA水平的表达升高及eIF4E磷酸化水平的降低均有明显的协同作用。3.3.2 LY-294002预处理对4E-BP1的影响Western blot检测结果显示,LY-294002预处理+ST 1000μg/L处理组内4E-BP1蛋白的表达明显低于ST单独处理组(P<0.05),而与溶剂对照组相比没有明显差别(P>0.05);4E-BP1磷酸化水平明显低于溶剂对照组(P<0.05),同时较ST 1000μg/L处理组细胞也明显降低(P<0.05)。RT-PCR结果表明,LY-294002预处理+ST组细胞4E-BP1 mRNA的表达与ST单独处理组相比明显降低,但仍高于溶剂对照组(P<0.05)。表明LY-294002预处理可阻断ST对GES-1细胞内4E-BP1在蛋白和mRNA水平的表达升高作用,但对ST诱导的4E-BP1磷酸化水平降低有明显的协同作用。3.3.3 LY-294002预处理对CyclinD1蛋白表达的影响LY-294002预处理+ST 1000μg/L处理组CyclinD1蛋白的表达明显低于溶剂对照组(P<0.05),同时显著低于ST 1000μg/L处理组(P<0.05),表明LY-294002预处理对ST诱导的GES-1细胞内CyclinD1蛋白表达降低有明显的协同作用。结论:1杂色曲霉素作用于GES-1细胞24 h,可以激活JNK、ERK和PI3K信号转导通路,同时可以抑制p38信号转导通路。2杂色曲霉素可能通过激活JNK和ERK信号转导通路影响GES-1细胞周期分布,诱导G2期阻滞;但PI3K信号转导通路的激活在杂色曲霉素诱导的G2期阻滞中可能发挥反向调节作用。3杂色曲霉素作用于GES-1细胞可通过激活JNK、ERK和PI3K信号转导通路而影响Cdc25C -Cdc2/CyclinB1的表达和功能,可能是杂色曲霉素诱导细胞G2期阻滞的机制之一。4 JNK、ERK和PI3K信号转导通路的激活可能均参与了ST对体外培养胃黏膜上皮细胞GES-1的影响。但PI3K信号转导通路的激活此过程中可能主要发挥反向调节作用。