猪血凝性脑脊髓炎(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis)是由血凝性脑脊髓炎病毒(Hemagglutinating encephalomyelitis virus, HEV)引起仔猪的一种急性、高度接触性传染病。HEV属于冠状病毒属的成员,其主要侵害1～3周龄的仔猪,临床上以仔猪呕吐、衰竭和明显的神经症状为主要特征,死亡率高达20～100%。自1958年本病在加拿大的安大略省首次爆发以来,此后许多国家均有该病的报道。血清学检测结果证明猪感染HEV很普遍,可能呈世界性分布。2006年8月,阿根廷的部分猪场发生该病,导致1226头猪死亡,发病率高达52.6%。我国早在1985年报道了北京郊区某种猪场发生HEV感染,其后吉林、辽宁、山东以及台湾等地区也相继报道。1994年台湾地区发生HEV大规模流行,病死率几乎达100%,造成严重的经济损失。国外学者的血清学调查发现,猪的HEV感染非常普遍,呈世界性分布,对养猪业发展已构成严重威胁。但HEV是如何感染机体的,目前还不清楚,正是由于其感染机制不清楚,所以在该病的防治方面还缺乏有效的手段。鉴于该病的流行趋势和对我国猪群所造成的危害,积极开展HEV致病机制的研究具有重要的理论价值和现实意义。目前,对于HEV的致病机理尚不清楚。为了更好地防治该病,或者从根本上彻底消除该病,对其发病机理的研究显得尤为重要。由于冠状病毒具有识别特定宿主细胞的相应受体,继而选择性的感染特定物种细胞的特点,因此,在神经系统病变部位,尤其是神经细胞表面很可能存在HEV受体,也正是这些受体介导了病毒侵入细胞的途径。但是,HEV的细胞受体及由受体介导的感染机制目前还不清楚。为了研究猪血凝性脑脊髓炎病毒在神经细胞上的受体及由其介导的感染机制,本研究首先培养原代小鼠神经细胞,建立小鼠神经细胞T7噬菌体表面展示文库,利用真核表达的S1蛋白和HE蛋白分别对文库进行筛选,通过筛选共获得四种侯选受体基因,分别是神经细胞粘附分子、剪接因子3b亚基2、组氨酸脱乙酰基酶2和核糖体蛋白S13。用生物学软件对四种侯选受体基因进行结构和功能分析发现其中的三种基因在体内各种组织细胞中表达,推测其介导HEV嗜神经传播的可能性较小,未对其做深入鉴定;而神经细胞粘附分子(NCAM)的作用和HEV的嗜神经性密切相关,推测其可能与HEV病毒感染相关。对NCAM基因进行原核表达,制备其多克隆抗体。利用制备的NCAM蛋白多抗进行细胞阻断试验,表明NCAM蛋白的抗体可显著抑制HEV对小鼠神经细胞的感染,说明NCAM蛋白在介导HEV感染神经细胞中起重要作用。采用半定量RT-PCR方法检测NCAM蛋白在猪中枢神经系统中的表达量,NCAM蛋白在大脑、脊髓中表达量比其它组织大,这也与接种HEV后病毒在脑、脊髓中含量比其它组织多相符合,表明NCAM与HEV感染相关。采用免疫组化技术检测NCAM蛋白在中枢神经系统包括大脑、小脑和脊髓中均有表达,这与HEV在猪中枢神经系统的分布特征基本相同,进一步说明NCAM蛋白在HEV感染神经细胞中起重要作用,NCAM蛋白可能是HEV在神经细胞上的受体,为进一步研究HEV的致病机制,研究抗HEV的药物或疫苗奠定基础。此外,本研究对由病毒引起的慢性神经系统疾病也具有重要的参考价值。原代培养小鼠神经细胞。取出生后1d的新生小鼠,断颈处死后,用眼科镊剥出整个脑组织,用0.25 %胰蛋白酶消化处理后,置37℃、5 %CO2培养箱内培养。用倒置显微镜观察刚分离的神经细胞,细胞数量很多,呈圆形,有少量细胞长有短小的轴突。培养4～5d后,大部分细胞都可见轴突,并开始相互迁移靠近,互相形成网络。培养6～8 d后,细胞间网络更加密集,轮廓清晰,立体感强。培养8～10d后,细胞间开始形成网束状。13d～20d为生长高潮,生长趋于稳定,细胞成熟。随后细胞数减少,空泡变性细胞开始出现。研究发现原代培养13d到20d的小鼠神经细胞可以用于建立噬菌体文库。构建小鼠神经细胞T7噬菌体展示文库。用Trizol提取小鼠神经细胞总RNA,用Poly(A)Quick mRNA Isolation Kit提纯mRNA,然后分别使用Novagen公司的OrientExpress Random Primer cDNA Synthesis Kit、EcoRⅠ/ HindⅢEnd Modification Kit、Mini Column Fractionation Kit、DNA Ligation Kit和T7 Select 10-3b Cloning Kit,按照各试剂盒说明书进行操作,构建了体外培养的小鼠神经细胞T7噬菌体展示文库,未扩增文库的滴度为6.4×107 pfu/mL,文库容量为1.52×107个重组子。对随机挑取的100个噬菌斑进行PCR鉴定,文库重组率为94%,86%的插入片段大于0.3kb,扩增后文库滴度为9×1010pfu/mL。扩增后的文库可以用来筛选HEV的受体。血凝性脑脊髓炎病毒受体基因的筛选。小鼠神经细胞长成单层后,用真核表达的S和HE蛋白对扩增后的文库进行筛选,共进行5轮筛选,将第五轮筛选后的上清铺板。挑选单个噬菌斑,提取噬菌体DNA ,以提取的噬菌体DNA为模板,进行PCR扩增,检测电泳插入片段大小。每次筛选随机挑取100个噬菌斑进行PCR,结果显示80个以上的插入片段大小一致,占挑取的总噬菌斑数的80%以上。将筛选获得的噬菌体插入片段送生物公司测序。测序后,经BLAST分析,共筛选出四种不同的蛋白基因。但是只有神经细胞粘附分子(NCAM)是神经细胞相关性蛋白基因,其它三种蛋白基因在体内到处都有表达,不可能是HEV的受体,所以不对这三种蛋白进行分析。用DNAStar软件分析NCAM的核酸序列,用ScanProsite和InterPro Scan分析氨基酸序列。分析结果显示神经细胞粘附分子的作用和HEV的嗜神经性密切相关。NCAM基因的原核表达。为进一步研究NCAM蛋白在HEV病毒感染中的作用,对NCAM基因进行原核表达。选择原核表达载体pGEX-4T-1,因为其能在大肠埃希菌中表达融合蛋白,使重组蛋白具有生物活性。根据GenBank,设计NCAM基因引物,连接克隆载体pMD18-T Simple Vector,酶切鉴定后,连接表达载体pGEX-4T-1,诱导表达,根据标签蛋白进行亲和层析纯化。扩增NCAM基因片段为1281bp,诱导表达蛋白经Western blotting检测,具有生物活性。亲和层析纯化后的重组NCAM蛋白,经蛋白测定仪检测,蛋白纯度达92%,蛋白含量是15.43μg/ mL。重组NCAM蛋白多克隆抗体的制备及NCAM蛋白抗体抑制病毒增殖效果研究。免疫家兔制备多抗,将重组NCAM蛋白对家兔进行三次免疫,制备多克隆抗体。用重组NCAM蛋白包被ELISA板,检测家兔的抗体效价为1:16000;阴性对照未检出效价。用饱和硫酸铵方法纯化多抗,将制备的多抗加入神经细胞预先感作,然后接HEV。接毒36h后,试验组细胞培养上清液中的HEV血凝效价是1:20,对照组细胞培养上清液中的HEV血凝效价是1:23,两组间血凝效价相差三个梯度,差异显著。接毒48h后,试验组细胞培养上清液中的HEV血凝效价是1:22,对照组细胞培养上清液中的HEV血凝效价是1:24,两组间血凝效价相差两个梯度,两组间有明显差异。结果显示,NCAM蛋白抗体可显著抑制HEV增殖。NCAM蛋白在细胞及组织中的分布。用间接免疫荧光方法确定NCAM蛋白在细胞内的具体位置。免疫荧光结果显示,NCAM蛋白主要位于细胞膜,表明NCAM蛋白主要在细胞膜表达。免疫组化结果显示,NCAM蛋白在中枢神经系统包括大脑、小脑和脊髓中均有表达,与HEV在猪中枢神经系统的分布特征基本相同。鉴于以上研究,发现NCAM蛋白在HEV感染神经细胞过程中可能起着重要作用。