目前,抗生素和除草剂抗性基因仍然是主要的标记基因。越来越多的转基因植物进入环境释放或商品化种植。在百合转基因研究中,使用抗性标记基因有可能使可食用百合如兰州百合产生食品安全问题,而大多数观赏百合则可能由于环境释放威胁生态环境安全。另外,在对百合及其他植物进行多次遗传转化时,少数几种抗性标记基因使多个目的基因多次转化不易找到合适的选择标记,同时可能引起基因沉默。本文分别采用了两种安全标记方法构建载体,并将载体转化烟草,初步建立起安全标记筛选体系。这不仅有利于促进百合及其他植物转基因技术的发展也将缓解潜在的生物安全问题。主要研究内容与结果如下:本论文设计特异引物,利用PCR的方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中克隆出逆境诱导型启动子RD29A基因上游823bp调控序列,测序结果及分析表明,所克隆的序列与已报道的RD29A启动子有99%的同源性,并包括了ABA、DRE等逆境调控保守序列,可能在低温、干旱、高盐环境下诱导基因的表达。在此基础上,将RD29A低温诱导特性启动子应用于两种安全标记表达载体的构建。第一种载体是使用安全标记基因IPT,选择诱导型启动子RD29A在特定环境条件下调控正向筛选安全标记IPT基因表达。本论文从相关质粒中克隆出IPT基因,经一系列中间载体的构建,获得了具有诱导型启动子RD29A的PG-RD29A-IPT同时构建了具有组成型启动子35S的PG-35S-IPT表达载体作为对照。第二类是先采用抗性标记筛选出转化子后,去除抗性标记基因的位点特异性重组系统——Cre/Lox系统,本研究将诱导型启动子RD29A用于调控Cre基因的表达。在植物双价表达载体T-DNA区段,35s:NptⅡ:nos表达元件位于同向排列的Lox位点之间,然后通过构建一系列中间载体,再将RD29A:Cre:nos这一表达元件插入到Lox位点之间,目的基因将来可以插入到T-DNA区域两个同向排列的Lox位点之外,从而实现在植物遗传转化初期利用抗性筛选标记获得转基因植株,在得到转基因植株的基础上,通过冷环境诱导或者ABA诱导等方法调控Cre基因的表达从而删除选择标记,获得含有目的基因而无选择标记的嵌合体。这将是一种对当前植物转基因技术更为安全有效的标记系统。载体构建成功后,使用PG-RD29A-IPT和PG-35S-IPT进行了烟草的转基因,对其转化条件和低温诱导条件——烟草叶片预处理的时间、菌液侵染时间、低温诱导的时间,两种启动子及两种温度下外植体的表现进行了实验,结果表明RD29A启动子在4℃诱导12h时,能够很好的调控IPT基因的表达,使烟草外植体正常分化,从而初步建立起一种安全标记的筛选系统,最后对转基因烟草进行了PCR检测,并得到了阳性转基因苗。