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目的通过体外研究甜茶提取物——甜茶甙对口腔致龋菌变形链球菌的生长、粘附以及代谢的影响,探讨含有天然甜味剂的植物——广西甜茶对变形链球菌抑制的作用机制,为今后开发利用甜茶甙提供实验依据。方法1、甜茶甙溶液和菌液制备采用二倍稀释法,用TTY培养基将甜茶甙配制成40g/100ml至0.125g/100ml的溶液。将S.mutans于TSB培养基活化3h后,接种于MSB固体培养基37。C下厌氧培养48小时,挑取典型菌落于5ml无菌生理盐水内制成混悬液,调光密度值(Optical Density,OD)为1.0的菌悬液,用细菌计数板计算细菌的浓度。2、甜茶甙对变形链球菌生长的影响采用试管稀释法测定甜茶甙对S.mutans生长的最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)大小,并离心收集各试管细菌,置于2ml生理盐水中,混匀,紫外可见光分光光度计测OD540 nm值。3、甜茶甙溶液对S.mutans产酸作用的影响根据甜茶甙对变链菌MIC测定结果,选取MIC值以下5个浓度,用含1%蔗糖的TTY液体培养基稀释,接种等量的变链菌悬液,37。C下厌氧培养48小时,并求出培养前后的△pH值,并与同浓度的木糖醇的△pH值对比。4、甜茶甙溶液对S.mutans粘附作用的影响取MIC以下的5个浓度,用含1%蔗糖的TTY液体培养基进行甜茶甙溶液的对倍稀释,按甜茶甙溶液与菌液10:1比例接种,所有试管30°水平角厌氧培养48h后,将粘附到试管壁的细菌用NaOH溶液洗脱,测定OD540,并计算粘附抑制率,与同浓度的木糖醇的粘附抑制率对比。5、葡萄糖基转移酶(Glucosyltransferase,GTF)的提取和水不溶性胞外多糖(Insoluble exopolysaccharides)的检测取MIC以下的5个浓度,用TTY液体培养基配制不同浓度的甜茶甙溶液各3ml,加入S.mutans菌液0.3ml,厌氧培养后将细菌培养物离心,收集上清液,加入固体硫酸铵,离心后,将沉淀溶于磷酸盐缓冲液中透析,获得GTF粗酶。采用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定液总蛋白含量,采用Smogyi法测定酶一底物反应液中还原糖量。GTF活力单位(IU)定义为标准条件下(37℃反应1h每分钟从蔗糖释放1μmol还原糖所需的酶量),并计算酶的比活力。在沉淀物(菌体)中加入0.5mol/L的NaOH 5ml离心,并于上清液加入3倍体积的无水乙醇,离心,沉淀即为反应生成的水不溶性胞外多糖,用蒽酮法测定水不溶性胞外多糖的含量。与同浓度的木糖醇中S.mutans的酶活性和不溶性胞外多糖对比。结果1、在试管稀释法实验中,甜茶甙浓度在20g/100ml以上的培养基内无变链菌生长,浓度在10g/100ml以下的培养基内均有变链菌生长,且随着甜茶甙浓度的降低,溶液中变链菌的浓度增加。根据实验结果判定其MlC值是20g/100ml;且在甜茶甙浓度高于或等于0.313g/100ml时,甜茶甙组S.mutans的OD值总体均数低于阴性对照组(P<0.01),即当n≥0.313时对变链菌的生长有抑制性,且其抑制性随甜茶甙浓度升高而增加。2、产酸实验后各浓度组pH值均较实验前下降,而木糖醇组的产酸较多使其pH值下降较明显。各甜茶甙组间实验前后△pH(pH变化量)总体均数间均具有差异(P<0.05),在甜茶甙浓度为1.25 g/100ml时,S.mutans的△pH值变化量是最小的;甜茶甙组△pH值的总体均数间显著低于木糖醇组与阴性对照组△pH (P<0.001)。3、随着甜茶甙浓度的升高,粘附抑制率也随之增高。各浓度甜茶甙组粘附菌液的OD值的总体均数显著低于木糖醇组与阴性对照组(F=98.02,p<0.01);甜茶甙浓度组除5 g/100ml、2.5 g/100ml、1.25 g/100ml外,其余各组间均具有显著性差异(p<0.001)。4、甜茶甙溶液中S.mutans酶液中总蛋白、GTF酶活力、水不溶性胞外多糖的结果4.1随着甜茶甙浓度的升高,S.mutans酶液中总蛋白的含量也在增加。不同浓度甜茶甙组总蛋白含量高于木糖醇组和阴性对照组(P<0.01);而阴性对照组则高于木糖醇组(P<0.01);甜茶甙各浓度组除了0.625 g/100ml、0.313 g/100ml,其余各组间总蛋白含量的总体均数均具有显著性差异(p<0.001)。4.2随着甜茶甙溶液浓度的逐渐升高,S.mutans的GTF活性逐渐降低。阴性对照组的还原糖量、酶活力、比活力均高于甜茶甙组、木糖醇组(p<0.05);不同浓度木糖醇组的酶活力显著高于甜茶甙组(p<0.001);甜茶甙组除了5 g/100ml、2.5 g/100ml、1.25 g/100ml,其余各组间还原糖量、酶活力、比活力的总体均数均具有显著性差异(p<0.001)。4.3随着甜茶甙溶液浓度的逐渐升高,S.mutans生成的水不溶性胞外多糖含量呈下降趋势;阴性对照组变链菌合成水不溶性胞外多糖的能力显著高于甜茶甙和木糖醇组(p<0.001);甜茶甙浓度组除了5 g/100ml、2.5 g/100ml、1.25 g/100ml外,其余各组间具有显著性差异(p<0.001)。经Pearson相关检验,甜茶甙组和木糖醇组的GTF酶活性与IS含量之间均呈正相关关系。结论1、甜茶甙对S.mutans的生长具有明显的抑制作用。2、甜茶甙可以抑制S.mutans产酸,并显著抑制S.mutans在表面的粘附作用,其抑制作用明显高于同浓度的木糖醇。3、甜茶甙对S.mutans菌液中葡萄基转移酶的酶活性具有一定抑制作用,降低了S.mutans水不溶性胞外多糖的合成,较同浓度的木糖醇有更明显的抑制作用。4、在龋病防治领域,作为天然植物甜茶的提取物,甜茶甙可望成为新的甜味剂。