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胃癌是我国发病率和死亡率均居前列的恶性肿瘤,严重危害人民健康。目前胃癌的治疗手段主要有手术、化疗、放疗。化疗在胃癌治疗中占据重要地位。顺铂(cisplatin)是临床上重要的一线化疗药物之一,广泛用于治疗包括胃癌在内的大多数肿瘤。然而,胃癌细胞容易对顺铂产生耐药性,导致化疗失败,患者死亡。不仅如此,肿瘤细胞还会对其他药物产生交叉耐受,如三氧化二砷。肿瘤耐药机制复杂多样,但归根结底是由于胃癌细胞抵抗了化疗药物诱导的细胞凋亡。但其具体机制至今仍不是很清楚。因此,研究胃癌细胞顺铂耐药和多药耐药产生过程中凋亡网络演变规律将为认识肿瘤耐药分子机制,发展有效的肿瘤耐药逆转策略提供科学依据。TXNL1属于硫氧还蛋白(Thioredoxin, Trx)家族成员,分子量32KD。硫氧还蛋白家族包括Trx1、Trx2、TXNL1、TXNL2等成员,主要负责调节细胞内氧化应激平衡,广泛参与由氧化应激所致的各种疾病过程。本课题组前期研究发现,在通过浓度梯度法诱导产生的胃癌顺铂耐药细胞中,XRCC1表达异常升高；抑制耐药细胞中XRCC1表达可提高其对顺铂的敏感性,而升高敏感细胞中XRCC1表达则可降低其对顺铂的敏感性。而二维电泳—质谱法筛选发现TXNL1在耐药细胞中表达显著下降。TXNL1与XRCC1表达在应对三氧化二砷所致氧化应激过程中呈相反趋势。在耐药细胞中回复TXNL1表达可抑制XRCC1表达并增强顺铂所致DNA损伤；在敏感细胞中抑制TXNL1表达则上调XRCC1表达并抑制顺铂所致DNA损伤。进一步研究证明TXNL1可介导XRCC1泛素—蛋白酶体途径降解。这些结果提示胃癌细胞中TXNL1参与了对顺铂耐药的调节。然而,TXNL1能否调节顺铂诱导的细胞凋亡则尚不明确,值得进一步研究。P38的磷酸化水平与微管的稳定性密切相关。我们前期研究发现p38磷酸化程度影响了微管蛋白的稳定性,而实验结果也表明在相同浓度的As203刺激时,耐药细胞的p38磷酸化程度要远远低于敏感细胞,而在敏感细胞中降低了p38磷酸化水平则能有效的提高敏感细胞的微管的稳定性和对As203的耐受性。这些结果表明,p38-微管通路在以后化疗多药耐药的治疗中可能成为一个潜在的治疗靶点。目的：研究胃癌细胞中TXNL1调节顺铂诱导细胞凋亡,三氧化二砷(AS203)通过P38磷酸化调节胃癌顺铂耐药细胞凋亡的分子机制。方法：利用课题组已经诱导建立的两株胃癌顺铂耐药细胞株BGC823/DDP和SGC7901/DDP,通过克隆形成、免疫荧光、免疫印迹法等细胞分子生物学技术研究TXNL1在顺铂诱导的细胞凋亡和P38磷酸化在细胞微管蛋白聚合程度和细胞多药耐药性的过程中发挥的作用及分子机制。结果：1.胃癌顺铂耐药细胞显著抵抗顺铂诱导的细胞凋亡。在相同浓度顺铂处理时,敏感细胞发生显著的细胞凋亡,而耐药细胞则几乎不发生细胞凋亡。2.胃癌顺铂耐药细胞中TXNL1表达水平显著降低,参与调节顺铂所致DNA损伤修复—细胞凋亡过程。在顺铂诱导的DNA损伤和细胞凋亡过程中,TXNL1表达呈先低后高,TXNL1低表达促进DNA修复,而TXNL1高表达则促进细胞凋亡。3. TXNL1通过促进顺铂诱导的细胞凋亡调节顺铂耐药性。在BGC823.SGC7901细胞中转染TXNL1 siRNA可以显著抑制顺铂诱导的细胞凋亡,减少顺铂所致细胞毒性效应。在BGC823/DDP、SGC7901/DDP细胞中转染flag-TXNL1表达质粒上调TXNL1表达可以显著增加顺铂诱导的细胞凋亡,增强顺铂所致细胞毒性效应。4. TXNL1通过负调控Bcl-2表达激活线粒体凋亡通路。免疫印迹结果显示耐药细胞中Bcl-2表达显著增加,与TXNL1表达呈相反趋势。TXNL1 siRNA抑制BGC823、SGC7901细胞TXNL1表达可以上调Bcl-2表达,而flag-TXNL1表达质粒增加BGC823/DDP、SGC7901/DDP细胞TXNL1表达可以下调Bcl-2表达。TXNL1通过转录水平负调控Bcl-2表达,进而影响下游线粒体凋亡通路调控细胞凋亡。5.耐药细胞相对于敏感细胞对AS203具有显著的耐受性。在相同的浓度的As203处理SGC7901、SGC7901/DDP细胞后CCK-8、AV-PI结果均显示SGC7901/DDP细胞对As203的耐受性显著升高。6. SGC7901/DDP细胞中的微管稳定性要高于SGC7901细胞。在相同的浓度的As203处理SGC7901、SGC7901/DDP细胞后免疫荧光法结果显示SGC7901/DDP细胞中微管稳定性显著高于SGC7901细胞。7. SGC7901/DDP细胞中p38的磷酸化程度远远低于SGC7901细胞。在相同的浓度的As203处理SGC7901、SGC7901/DDP细胞后免疫印迹法法结果显示SGC7901/DDP细胞中P38的磷酸化程度显著低于SGC7901细胞。8.抑制SGC7901细胞中P38的磷酸化能显著减少细胞中微管的聚合和凋亡。As203处理经,相对于未经P38抑制剂处理过的SGC7901细胞,前者细胞的微管聚合和凋亡程度显著低于后者。结论：本研究首次发现TXNL1可通过激活线粒体凋亡通路促进顺铂诱导的细胞凋亡。该研究成果将为发展以TXNL1为靶点的干预措施逆转顺铂耐药提供科学依据。SGC7901/DDP细胞对As203的耐受性与细胞内P38磷酸化水平有关,微管聚合是胃癌细胞耐受As203的重要机制。