敲除食蟹猴APOBEC3G基因的技术体系研究

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获得性免疫缺陷综合征又称为艾滋病,是一种由免疫缺陷病毒引起的严重致死性的免疫系统的疾病。由于该病复杂的发病机制等因素无法获得相关的动物模型。许多研究表明APOBEC3G是重要的抑制逆转录病毒感染的限制因子。载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like protein 3 protein G,APOBEC3G)具有胞嘧啶脱氨酶活性。在逆转录反应中,APOBEC3G通过催化病毒负链cDNA中的胞嘧啶脱氨尿嘧啶,引发基因组大量碱基超突变进而发挥抗病毒作用。而HIV-1编码的VIF蛋白可经泛素-蛋白酶体的降解途径来拮抗APOBEC3G的抗病毒活性。CRISPR/Cas9经过修饰后成为了可高效特异性识别和切割的基因组编辑工具。当外源体入侵机体时,机体会识别外源片段同时CRISPR序列会记忆RNA,当噬菌体等入侵第二次时机体会自动识别,CRISPR系统的Cas酶就在识别处切割基因组,从而达到编辑作用。而这种技术在人为修改后被用于目的基因的靶向切割,起到修饰基因改变蛋白表达的作用。本论文希望敲除APOBEC3G上表达CD结构域的基因,使得无法合成CD域,导致APOBEC3G无法结合病毒从而无法发挥抗逆转录作用。为此,本论文设计了三个连续的实验,具体的实验设计,研究内容和实验结果如下:实验一:在APOBEC3G上构建有效的sgRNA。首先,培养了两批野生株食蟹猴胚胎成纤维细胞,设计引物进而获得它们第六外显子的序列,再将两者多次反复进行比较得到第六外显子SNP。再与NCBI上的进行比较,最终得到第六外显子确切序列,运用CHOPCHOP等软件设计多个sgRNA,在体外验证设计靶位点的活性。发现sgRNA1和sgRNA3的体外靶位点活性较强,合成相应的质粒。实验二:在食蟹猴胚胎成纤维细胞上验证敲除。使用合成的质粒和lopi3000转染进行细胞上的转染,并且进行抗性筛选后增殖细胞数量,得到的应该均为转染进去的细胞,提取基因组片段扩增后进行酶切检验后送测序。发现转染后的细胞有荧光并且酶切检验的时候看到明显的酶切片段,送测序后对比发现在设计的靶位点sgRNA1和sgRNA3附近均发生敲除。实验三:在食蟹猴胚胎上验证基因敲除。结合靶位点的活性和细胞敲除的情况,选定了sgRNA3作为在胚胎上验证的靶点序列。体外合成sgRNA3和Cas9的mRNA混合后,运用胚胎注射技术注射17枚胚胎,培养后检验敲除的情况。发现sgRNA3在胚胎上同样发生敲除。综合上述实验结果,本论文获得了具有较强活性的sgRNA1和sgRNA3并且构建了相应的质粒载体,运用载体在食蟹猴胚胎成纤维细胞和食蟹猴胚胎上均进行了验证,证明设计的靶位点均发生敲除。本论文研究为建立敲除食蟹猴APOBEC3G基因建立相应的技术体系,为建立艾滋病易感疾病动物模型提供了思路。为早日得到艾滋病易感模型踏出了坚实的一步。
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