目的:食管癌位于世界常见恶性肿瘤的第四位,其病死率高,预后差,患者总体的5年生存率仅为10%左右,已严重危害人民的生命健康。中国是食管癌高发的国家之一,全世界每年新确诊的食管癌中有近一半发生在中国。在中国,食管鳞癌是食管癌最常见的病理类型。近年来,虽然食管鳞癌的治疗水平得到了较大幅度的提高,但是患者远期生存仍不乐观。研究表明,早期诊断和治疗可以改善食管鳞癌患者的预后,鉴于一些分子标记物在肿瘤发生之前就已经发生了变化,所以通过检测这些分子标记物将有助于食管鳞癌的早期诊断和治疗。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成员之一,它通过抑制细胞的凋亡,参与肿瘤的发生、发展,并与肿瘤的分期和患者的预后有关。转录因子NF-κB家族,特别是NF-κB p65(RelA)亚基可通过调控多种基因的表达,影响细胞增殖、凋亡和分化,在肿瘤的发生过程中起着重要作用。我们的前期研究发现,通过抑制食管鳞癌细胞中Survivin的表达,会导致磷酸化NF-κB p65的蛋白表达水平降低,提示在食管鳞癌中Survivin对NF-κB p65的表达可能具有调控作用。但是,目前对于Survivin调控NF-κB p65表达的具体机制及作用位点尚不清楚。因此,本研究使用YM155、LV3-Survivin shRNA重组质粒下调Survivin的表达,使用GV142-Survivin过表达重组质粒上调Survivin的表达,通过对NF-κB p65及其上游基因IKKα、IKKβ的表达进行检测,来探讨Survivin是否通过调控IKKα、IKKβ的表达,影响NF-κB p65的活化;最后对Survivin调控NF-κB p65表达的作用位点,以及调控Survivin表达对细胞生物行为的影响进行研究。方法:1)人食管鳞癌ECA109和KYSE150细胞培养,使用不同浓度的Survivin抑制剂YM155作用于细胞作为实验组,完全培养基处理细胞作为空白对照组。48h后收集细胞,使用台盼蓝染色,进行细胞计数,评估YM155对细胞存活的影响。并在48h后收集细胞提取总RNA和蛋白,使用RT-qPCR以及Western blotting对Survivin、NF-κB p65及其上游基因IKKα、IKKβ的表达进行检测,验证Survivin是否通过调控IKKα、IKKβ的表达,影响NF-κB p65的活化;2)人食管鳞癌ECA109和KYSE150细胞培养,构建LV3-Survivin shRNA,LV3-control重组质粒。LV3-Survivin shRNA重组质粒瞬时转染细胞,构建Survivin低表达的食管鳞癌细胞组,LV3-control重组质粒瞬时转染细胞作为阴性对照,完全培养基处理细胞作为空白对照组。转染后48h收集细胞提取总rna和蛋白,使用rt-qpcr以及westernblotting检测survivin的表达,验证转染效率。并检测nf-κbp65及其上游基因ikkα、ikkβ的表达,验证survivin是否通过调控ikkα、ikkβ的表达,影响nf-κbp65的活化。并使用流式细胞仪对细胞的周期和凋亡进行检测,评估下调survivin表达对细胞周期和凋亡的影响;3)人食管鳞癌eca109和kyse150细胞培养,构建gv142-survivin过表达重组质粒。gv142-survivin过表达重组质粒瞬时转染细胞,构建survivin过表达的食管鳞癌细胞组,gv142空白质粒瞬时转染细胞作为阴性对照,完全培养基处理细胞作为空白对照组。转染后48h收集细胞提取总rna和蛋白,使用rt-qpcr以及westernblotting检测survivin的表达,验证转染效率。并检测nf-κbp65及其上游基因ikkα、ikkβ的表达,验证survivin是否通过调控ikkα、ikkβ的表达,影响nf-κbp65的活化。并使用流式细胞仪对细胞的周期和凋亡进行检测,评估上调survivin表达对细胞周期和凋亡的影响;4)染色质免疫共沉淀实验:为了证实survivin蛋白是否通过与ikkα和/或ikkβ启动子区的直接或间接结合,通过调控ikkα和/或ikkβ启动子的转录活性,影响nf-κbp65的活化。我们将人食管鳞癌eca109和kyse150细胞瞬时转染gv142-survivin过表达重组质粒,使用survivin特异性抗体免疫沉淀与survivin蛋白结合的dna片段,并使用ikkα和ikkβ启动子区特异性引物对免疫沉淀的dna片段进行pcr扩增、鉴定;5)双荧光素酶报告基因实验:人食管鳞癌细胞eca109和kyse150细胞培养,构建并转染ikkβ启动子区的荧光素酶报告基因质粒pgl3-ikkβpromoter,并同时共转染prl-tk质粒和/或gv142-survivin过表达重组质粒,以评估survivin对ikkβ启动子区转录活性的调控作用。结果:1)survivin的特异性抑制剂ym155作用于eca109和kyse150细胞可以抑制细胞存活,并下调nf-κbp65及其上游基因ikkα和ikkβ在转录水平的表达,下调磷酸化的nf-κbp65及其上游基因ikkα和ikkβ在蛋白水平的表达;2)瞬时转染lv3-survivinshrna重组质粒可以下调eca109和kyse150细胞中survivin在转录和蛋白水平的表达。survivin的表达下调同时伴随有nf-κbp65和其上游基因ikkα,ikkβ在转录水平的表达下调,以及磷酸化的nf-κbp65和其上游基因ikkα,ikkβ在蛋白水平的表达下调。在eca109和kyse150细胞中下调survivin的表达可以促进细胞凋亡,并导致细胞周期阻滞于g2/m期;3)瞬时转染gv142-survivin过表达重组质粒可以上调eca109和kyse150细胞中survivin在转录和蛋白水平的表达。survivin的表达上调同时伴随有nf-κbp65和其上游基因ikkα,ikkβ在转录水平的表达上调,以及磷酸化nf-κbp65和其上游基因ikkα,ikkβ在蛋白水平的表达上调。在eca109和kyse150细胞中上调survivin的表达可以抑制细胞凋亡,并导致细胞周期的g2/m期缩短;4)染色质免疫共沉淀实验显示,在eca109细胞中,survivin蛋白可以直接或间接与IKKβ启动子的0至-700bp片段结合;5)双萤光素酶报告基因实验结果显示,在ECA109细胞中,Survivin可以上调IKKβ启动子的转录活性。结论:1)在食管鳞癌ECA109、KYSE150细胞中,通过抑制Survivin的表达,会使NF-κBp65以及其上游基因IKKα,IKKβ在转录水平的表达发生下调,并抑制NF-κBp65在蛋白水平的活化;通过上调Survivin的表达,会使NF-κBp65以及其上游基因IKKα,IKKβ在转录水平的表达发生上调,并促进NF-κBp65在蛋白水平的活化;2)在食管鳞癌ECA109细胞中,Survivin能与NF-κB p65上游基因IKKβ的启动子0至-700区域发生直接或间接结合;3)Survivin可以上调IKKβ启动子的转录活性,提高IKKβ在体内的表达水平,以促进NF-κB p65的活化;4)过表达的Survivin可以活化NF-κB p65,抑制细胞凋亡,促进细胞增殖,参与食管鳞癌的发生、发展。