Kindlin家族是上世纪50年代新发现的一类粘着斑蛋白家族,到目前为止,该家族已确定的家族成员有3个(Kindlin-1,Kindlin-2,Kindlin-3)。目前的研究证实,该家族成员在进化上不仅具有高度的同源性还具有高度的保守性,其中Kindlin-1与Kindlin-2蛋白具有62%的氨基酸同源性,Kindlin-1与Kindlin-3具有49%的氨基酸同源性,而Kindlin-2与Kindlin-3则具有53%的氨基酸同源性。Kindlin家族蛋白的结构域由恒定区和可变区结构域组成。所有的Kindlin家族蛋白的恒定区均含有一个典型的FERM结构域,并且此结构域均被插入了一个PH结构域。前期的研究表明,FERM结构域多存在于细胞的骨架蛋白,这一结构域由3个亚结构域组成,分别为F1、F2、F3亚结构域,且均有有F0亚结构域存在于核心序列F1、F2、F3亚结构域前。Kindlin家族中F3亚结构域与踝蛋白FERM中的F3亚结构域高度相似,两者都含有磷酸酪氨酸结合区(phosphotyrosine-binding domain,PTB),此磷酸酪氨酸结合区可以与整合素β亚基的胞质尾区结合。尽管在细胞内有多种蛋白质都与β整合素胞内段相互作用,但是在Kindlin家族蛋白功能得到阐明前,仅仅踝蛋白被证实能够触发整合素的活化。然而在2008年由Moser等进行的在Kindlin-3基因敲除的小鼠研究中,证实Kindlin家族蛋白才是整合素活化所必需的。在整合素的激活过程中,Kindlin-2发挥着至关重要的作用,由Kindlin-2触发的整合素的活化的信号传导分为由内到外传导和由外到内的两个传导过程。首先是从内到外的传导过程,kindlin-2在受到细胞内的激动剂作用后,它的F3亚结构域会直接与整合素β亚基胞内末端的序列结合并募集踝蛋白(tailin)于此结合区,从而使整合素与可溶性蛋白、细胞外基质(ECM)等配体的亲和力由低亲和状态转变为高亲和状态,最终上调整合素受体与配体的结合能力,完成由内向外的信号转导。其次是由外到内的转导过程,在这一过程中,整合素主要通过整合素连接激酶(ILK)参与细胞迁移、增殖和存活。已有文献报道称Kindlin家族蛋白与ILK在原始内胚层中存在相互作用,此外,也有研究表明在C2C12的心肌细胞中下调Kindlin-2的表达会导致ILK的异常聚集,从而导致细胞的粘附异常和迁移增加。同样也有文献报道称,在Kindlin-3基因敲除的小鼠的实验中,Kindlin-3基因敲除的细胞会出现细胞延展障碍,且ILK不能被募集到整合素结合位点。此外就是,Kindlin-2可通过与黏附结构蛋白、血管扩张激活的磷酸蛋白(vasodilator-stimulated phosphoprotein,VASP)、细丝蛋白(filamin)及与整合素胞质内段相结合,定位于细胞-基质黏着斑,构成细胞-基质黏附复合体与肌动蛋白细胞骨架之间的重要连接。另外有研究表明,Kindlin-2在癌症的发生发展中可能也起着重要作用。已有研究报道称Kindlin-2表达水平的改变与一些肿瘤的发生发展密切相关。例如,在多种结肠癌细胞系中,Kindlin-2的表达水平都较低甚至无表达;Kindlin-2在平滑肌肉瘤中表达正常,但在平滑肌瘤中却过量表达;另外,高水平的Kindlin-2与间质癌细胞的侵袭力降低有关。但同时也有研究表明Kindlin-2在恶性黑色素瘤中高表达,并促进肿瘤细胞粘附和迁移。这些实验结果都证实Kindlin-2与肿瘤的发生发展密切相关。然而,Kindlin-2参与肿瘤发生发展、侵袭及转移过程的机制尚不清楚。鉴于Kindlin-2在肿瘤发生发展中的重要作用,我们开始了寻找新的与Kindlin-2相互作用的蛋白。我们利用特异性抗Kindlin-2抗体对前列腺癌细胞系PC-3细胞的裂解产物进行了 pulldown实验,样品利用2-D荧光差异蛋白表达分析系统(2-D DIGE)进行分析,证实与kindlin-2相互作用的蛋白为过氧化物氧还蛋白(peroxiredoxin,Prdx)家族中的一个成员Prdx4。过氧化物酶还原蛋白(Prdxs)是一个多功能蛋白家族,其主要功能是抵抗活性氧(reactive oxygen species,ROS)的破坏作用,但是其抵抗活性氧的催化机制与其它抗氧化酶类如超氧化物岐化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等完全不同。过氧化物酶蛋白家族(Prdxs)分子量大小约为20-30KDa,广泛分布在生物体内。目前该家族成员有六个亚型,根据过氧化物酶蛋白参与氧化还原反应的半胱氨酸残基数目,分为三类:分为典型2-Cys-Prdx(Prdxl-4)和非典型2-Cys-Prdx(Prdx5),以及1-Cys-Prdx(Prdx6)。此外,该家族系中的六个亚型在人体组织和细胞的定位也有显著的区别。Prdxs家族抵抗活性氧的作用的功能具有两面性。一方面,Prdx可作为过氧化物还原酶,通过清除活性氧从而对细胞产生保护作用,这一功能对机体有利。另一方面,当组织和细胞持续暴露在氧化应激条件下,将发生DNA损伤,与此同时受损的线粒体产生的ATP减少,使细胞自身修复DNA能力下降,最终导致基因突变,而此时由氧化应激反应诱导的Prdx表达水平上调可使细胞免于凋亡,从而导致肿瘤的发生。越来越多的证据提示Prdx4的表达水平与肿瘤的发生发展密切相关,甚至有人提出将Prdx4作为前列腺癌活检的生物学标志物。此外,已有文献报道,Prdx4在肺癌中的表达水平也发生上调。已有许多文献报道称过表达的过氧化物酶蛋白家族(Prdxs)成员与许多肿瘤的发生与发展息息相关,例如Prdx5可以作为人乳腺癌普查的标志,Prdx1和Prdx4在膀胱癌和肺癌组织中出现表达量增高及Prdx4在结肠癌中的表达量也升高。此外,还有文献报道称Prdx3和Prdx4在前列腺癌组织中的表达量增高,甚至有人提出将Prdx4作为前列腺癌生物学活检的标志物。同时有研究证实当下调或敲除Prdx4的表达时,会导致胃癌组织的生长受限和凋亡增多且会导致精原细胞的凋亡。综上所述,我们推测Kindlin-2与Prdx4的相互作用可能在在肿瘤的发生发展中发挥着重要的调控作用。通过对两者的相互作用的研究,增加我们对肿瘤发生发展的认识,而且为炎症状态下氧化应激所导致的肿瘤等严重疾病的临床治疗提供新的思路。为了证实我们的推测,我们进行了以下实验:首先,我们采用脂质体瞬时转染法将表达质粒pcDNA3.0-HA/pcDNA3.0-HA--Prdx4或针对人Prdx4的siRNA转染人宫颈癌HeLa细胞,利用蛋白质印迹法来检测两者的蛋白表达水平。检测结果证实,过表达质粒pcDNA3.0-HA-Prdx4组HeLa细胞Prdx4蛋白表达明显增加,而干扰Prdx4组Prdx4蛋白表达水平下调。接着,我们利用MTT法检测过表达和干扰Prdx4表达后的HeLa细胞的增殖活性的高低。MTT检测结果显示,过表达pcDNA3.0-HA-Prdx4组HeLa细胞增殖能力与空白对照组及空转载体组比较,未发生明显改变(P>0.05),而干扰Prdx4组HeLa细胞增殖能力较对照组明显下降(P<0.05)。随后,我们采用FCM法检测过表达和干扰Prdx4蛋白表达后HeLa细胞的凋亡情况,FCM法检测结果显示,FCM检测结果显示,在NaAs02刺激诱导下,过表达pcDNA3.0-HA-Prdx4组的HeLa细胞凋亡能力未发生明显改变,与空白对照组和转染空载体的阴性对照组相比,差异无统计学意义(F=0.418,P>0.05);而3个hPrdx4 siRNA实验组与阴性对照siRNA组的HeLa细胞凋亡率差异有统计学意义(F=8.459,P<0.05),其中hPrdx4siRNAl、2、3及hPrdx4siRNAl+2+3组的凋亡细胞所占百分比分别为(36.85±3.02)%、(36.22±1.73)%、(5.58±3.24)%和(46.99±1.48)%,与阴性对照组的(24.75±3.45)%相比均明显升高(t=2.642,P<0.05;t=2.975,P<0.05;t=2.763,P<0.05;t=5.930,P<0.05)。最后,为了验证两者之间是否存在相互作用,我们对两者在体外的结合情况进行了离体结合研究。我们利用细菌转化技术在大肠杆菌株BL21中对GST-Kindlin-2和His-Prdx4质粒进行了融合蛋白的表达,并分别利用谷胱甘肽亲和树脂和Ni-NTA亲和树脂对这两种蛋白进行了纯化。随后在获得纯化蛋白的基础上,我们进行了离体结合实验。结果表明,结合在Ni-NTA亲和树脂上的His-Prdx4蛋白能将GST-Kindlin-2蛋白共沉淀下来,而在相同结合条件下,His-Prdx4蛋白对单独的GST蛋白则没有结合作用,这一实验结果说明Prdx4在离体条件下能与Kindlin-2结合。通过上述研究,可以得出以下的结论:1、表达质粒 pcDNA3.0-HA/pcDNA3.0-HA-Prdx4 或针对人 Prdx4 的 siRNA 成功转染人宫颈癌HeLa细胞。2、Prdx4蛋白表达水平的上调对HeLa细胞的增殖和凋亡没有明显影响。3、Prdx4蛋白表达水平的下调会导致HeLa细胞增殖抑制和凋亡增加。4、Kindlin-2和Prdx4在离体情况下能结合。