论文部分内容阅读
研究背景神经内分泌因子、生长因子及应力介导的心肌肥大信号通路已得到初步阐明。目前认为,小G蛋白家族在心肌肥厚的信号传导调控中发挥重要作用。但心肌细胞内小G蛋白如何向下游传递信号、最终如何启动促心肌细胞肥大的相关通路,目前并不十分明晰。作为一种保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,PAKs家族广泛参与了细胞骨架重组、细胞迁移、细胞增殖及基因转录等过程。它可以被小G蛋白Rac1/Cdc42磷酸化并激活,从而将Rac1/Cdc42的生物信号向下游传递。研究发现PAK1基因敲除后通过抑制JNK通路,可促进小鼠心肌肥厚及心力衰竭的发生,提示PAK1具有抗心肌肥厚作用;而PAK2可通过Erk1/2以及p70S6K通路促进心肌肥大。目前,PAK3在心室重构中的作用及其信号通路国内外尚无报道,我们推测PAK3在心肌细胞肥厚中亦发挥重要作用。因此本课题通过PAK3转基因小鼠建立主动脉缩窄模型,探究PAK3在心肌肥大、心室重塑中的作用,并进一步对相关机制进行探讨。研究方法实验一:分别取心衰患者(n=4)、行主动脉缩窄术(TAC)(n=8)的C57BL/6小鼠心肌、新生乳大鼠肥大的原代心肌细胞及各自对照,运用western blot、免疫组化的方法检测心肌肥厚时PAK3的磷酸化及总蛋白水平的表达。实验二:探讨PAK3在小鼠心肌肥厚中的作用。动物实验:选取8周龄、雄性、以C56BL/6为背景建立的PAK3-/-小鼠和野生型对照组,通过主动脉缩窄或者开胸假手术建立动物模型。实验动物分组:①假手术(Sham)野生型(WT,n=15);②假手术(Sham)PAK3基因敲除组(KO,n=20);③主动脉缩窄术(TAC)野生型组(WT,n=15);④主动脉缩窄术(TAC)PAK3基因敲除组(KO,n=20)。术前、术后1、2、4周心超检测心功能;4周后处死,比较各组小鼠心重比、心重胫骨长度比,通过心脏大体拍照、HE染色、mason染色等方法评估心脏肥大、心肌重塑指标;通过RT-PCR方法检测心衰相关分子指标。细胞实验:体外培养1-3天SD乳大鼠心肌细胞。分别转染LV-shPAK3与LV-GFP慢病毒,并予血管紧张素Ⅱ(AngⅡ,1 0 μmol/L)刺激。实验分组:①LV-GFP组;②LV-shPAK3组;③LV-GFP+Angl组;④LV-shPAK3+AngII组。通过免疫荧光的方式评估PAK3敲减对心肌细胞肥大表型的影响。实验三:探讨PAK3介导心肌肥厚的信号传导通路。体外培养1-3天SD乳大鼠心肌细胞,通过质粒转染过表达PAK3,检测PAK3是否诱导心肌细胞肥大表型,用Western blot方法检测MAPKs、AKT等心肌肥大信号通路的改变,并在PAK3敲除与野生型动物的心肌组织中验证。通过慢病毒干扰或者加入PAK3下游肥大相关通路抑制剂后,通过免疫荧光等方法检测是否可抑制PAK3介导的心肌细胞肥大。实验结果结果一:Western blot与免疫组化均显示在心衰患者、主动脉缩窄术后的小鼠心肌组织及体外诱导的肥大心肌细胞中,PAK3的磷酸化水平均明显增加(P<0.05),提示PAK3的磷酸化可能与心肌肥厚病理过程相关。结果二:动物实验:小鼠主动脉缩窄术后4周内PAK3敲除组小鼠存活率较野生型小鼠明显增加(85.0%Vs70.0%);术后四周PAK3敲除组小鼠心室腔显著减小,左室舒张末期内径(LVEDd)及左室收缩末期内径(LVESd)与野生型相比均明显减少(P<0.05),心功能明显改善;敲除组小鼠心脏体重比(HW/BW)、心脏胫骨长度比(HW/TL)均显著低于野生型组(P<0.05),HE染色发现,敲除组心肌细胞横截面积明显低于野生型小鼠(P<0.05);RT-PCR示PAK3敲除组的ANF、BA/P及β-MHC均显著低于野生型小鼠(P<0.05);Mason染色亦可见PAK3敲除后心肌纤维化程度较野生型明显减少。细胞实验:加入血管紧张素Ⅱ后,PAK3敲减组心肌细胞截面积明显小于对照组(P<0.05)。以上提示PAK3敲除可有效抑制心肌肥厚表型。结果三:PAK3过表达质粒转染乳大鼠原代心肌细胞后,免疫荧光示过表达PAK3后细胞表面积明显增大(P<0.05),Western blot方法检测见c-Raf-ERK1/2信号通路的激活。乳鼠心肌细胞过表达PAK3的同时抑制c-Raf和ERK的活化后,心肌细胞肥大的表型可被逆转。实验结论1、通过心衰患者、小鼠主动脉缩窄模型和异丙肾上腺素与血管紧张素Ⅱ刺激诱导心肌肥大模型,发现心肌细胞中PAK3的磷酸化水平显著上调。2、PAK3基因敲除可减少压力负荷诱导的小鼠的死亡率,可减轻压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚与纤维化,PAK3基因敲减可减轻血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大表型。3、PAK3主要通过c-Raf-ERK信号通路介导心肌肥厚与纤维化。