论文部分内容阅读
目的：构建葡聚糖硫酸钠盐（DSS）诱导的小鼠炎症性肠病（IBD）模型，通过体内外实验，探讨龙血竭不同极性萃取物对炎症性肠病的治疗作用，并分析其可能的作用机制。
方法：
（1）云南血竭用甲醇溶解，加入硅藻土拌匀，晾干。经95%乙醇回流提取，提取液减压回收乙醇得到1.75Kg乙醇提取物。乙醇提取物分别用二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇萃取，成功获得250g二氯甲烷萃取物（B-1）、850g乙酸乙酯萃取物（B-2）和444克甲醇萃取物（B-3）。其中二氯甲烷萃取层经硅胶柱色谱，以石油醚/丙酮梯度洗脱制备得到单体化合物loureirinA（B-1-1）。
（2）体外免疫磁珠分离野生型小鼠脾脏CD4+T细胞，3种萃取物设剂量为1μg/ml、10μg/ml、40μg/ml、70μg/ml和100μg/ml与ConA共育，1种单体化合物设剂量0.1μM、1μM、10μM、30μM和50μM与ConA共育，各给药组中ConA终浓度为5μg/ml，同时设空白对照组（培养液）、阴性对照组（培养液+细胞+5.0μg/mlConA）和阳性对照组（培养液+细胞+1.0μg/ml环孢素A）细胞给药后继续培养48h后MTT法检测CD4+T细胞的增殖情况。细胞增殖率=[（各加药组吸光度-空白对照组吸光度）/（阴性对照组吸光度-空白对照组吸光度）]×100%。
（3）通过自由饮用2.5％DSS的方式诱导小鼠炎症性肠病，将小鼠随机分为空白组、IBD组、龙血竭低浓度组（B-2-100mg/kg）、中浓度组（B-2-200mg/kg）和高浓度组（B-2-400mg/kg），从饮用DSS的第1天开始到第8天用不同浓度龙血竭灌胃，第3天注射绵羊红细胞（SRBC），在饮用DSS的第8天处死小鼠，制备脾细胞悬液，加入补体和绵羊红细胞悬液，酶标仪检测313nm波长处的吸光度值（OD值）。
（4）按照（3）中的方法分组和处理小鼠，在实验进程中，每天记录小鼠的情况及不同时间的疾病活动指数（diseaseactivityindex，DAI）；在饮用DSS的第8天处死小鼠，分离结肠组织，HE染色观察炎症浸润情况并进行组织学损伤指数（histologicalindex，HI）评分。
（5）流式细胞术（FCM）检测小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中CD4+IFN-γ+T细胞、CD4+IL-4+T细胞和CD19+B细胞的比例。
结果：
（1）从云南血竭中，利用95%乙醇和不同极性溶剂萃取分别获得二氯甲烷萃取物（B-1）、乙酸乙酯萃取物（B-2）、甲醇萃取物（B-3）和单体化合物loureirinA（B-1-1）。
（2）在体外ConA介导的小鼠脾脏CD4+T细胞增殖的体系中，B-1、B-2、B-3和B-1-1对ConA刺激的小鼠脾脏CD4+T细胞的增殖均有不同程度的抑制作用。其中B-1在40μg/mL时表现出对细胞具有显著的抑制作用，同时不影响细胞的存活率，高浓度时（70μg/mL和100μg/mL）虽然可以显著抑制CD4+T细胞的增殖，但同时毒性作用也较大。从B-1中靶向分离纯化得到主成分B-1-1浓度在1μM时细胞的增殖率为60.27±4.90%，50μM时细胞的增殖率为30.96±9.34%，且在效应浓度下对CD4+T细胞的存活率无显著影响。B-2在1μg/mL时即表现出显著的抑制作用，且抑制作用具有浓度依赖效应。几乎各个浓度的B-2对细胞的存活率均有一定的影响，但高浓度时的毒性作用小于B-1。B-3对ConA介导的小鼠脾脏CD4+T细胞增殖的抑制作用不明显，细胞的增殖仍比较旺盛，仅在高浓度70μg/mL和100μg/mL时有较弱的抑制作用。综合上述结果分析，我们选择B-2进行后续的体内实验。
（3）在溶血空斑实验中，龙血竭乙酸乙酯萃取物B-2不同浓度组，抗体水平均明显高于IBD组，结果提示B-2能有效地促进SRBC特异性抗体的生成。
（4）根据DAI评分标准，IBD组、B-2-100mg/kg治疗组、B-2-200mg/kg治疗组和B-2-400mg/kg治疗组小鼠自造模第3天起DAI分数均持续增加，但治疗组小鼠DAI指数在对应的时间点都低于IBD组。造模第8天，较对照组，B-2处理组小鼠结肠充血、肿胀和缩短的程度，以及病理评分均减轻或明显减轻（p＜0.05），表明B-2能有效延缓小鼠IBD进程。
（5）FCM结果显示，IBD组小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中的CD4+IFN-γ+T细胞的比例明显降低（p＜0.05），经过B-2-100mg/kg治疗后，小鼠脾脏中CD4+IFN-γ+T细胞的比例有升高趋势，B-2-200mg/kg治疗组小鼠脾脏中CD4+IFN-γ+T细胞的比例与IBD组相比明显增高，有显著性差异（p＜0.05），B-2-400mg/kg治疗组小鼠脾脏中CD4+IFN-γ+T细胞的比例又呈现下降趋势，肠系膜淋巴结中CD4+IFN-γ+T细胞的比例变化趋势与脾脏相似。
（6）FCM结果显示，IBD组小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中CD4+IL-4+T细胞的比例明显升高（p＜0.05），B-2-200mg/kg治疗组小鼠脾脏中CD4+IL-4+T细胞的比例与IBD组相比明显降低，有显著性差异（p＜0.01），B-2-400mg/kg治疗组小鼠脾脏中CD4+IL-4+T细胞的比例又呈现升高的趋势。相比于NC组小鼠，IBD组小鼠肠系膜淋巴结中CD4+IL-4+T细胞的比例明显升高（p＜0.01）。与IBD组相比，各浓度治疗组小鼠肠系膜淋巴结中CD4+IL-4+T细胞的比例均有显著性降低（p＜0.01，p＜0.001）。
（7）IBD组小鼠脾脏中CD19+B细胞的比例明显降低（p＜0.05），经过B-2-100mg/kg和B-2-200mg/kg治疗后，小鼠脾脏中CD19+B细胞的比例有明显地回升（p＜0.05，p＜0.01）。肠系膜淋巴结中CD19+B细胞的比例变化趋势与脾脏中相反，IBD组小鼠肠系膜淋巴结中CD19+B细胞的比例与NC组小鼠相比出现了增高的现象，变化有显著性差异（p＜0.01），经过不同浓度B-2的治疗，小鼠肠系膜淋巴结中CD19+B细胞的比例均出现了回落。
结论：
（1）成功制备云南血竭二氯甲烷萃取物（B-1）、乙酸乙酯萃取物（B-2）甲醇萃取物（B-3）和单体化合物loureirinA（B-1-1），体外实验证实对CD4+T细胞的增殖均有不同程度的抑制作用和毒性作用。
（2）各浓度B-2均可以有效减轻小鼠IBD的疾病程度，与促进CD4+IFN-γ+T细胞增殖、抑制CD4+IL-4+T细胞增殖和增强机体的体液免疫有关。
方法：
（1）云南血竭用甲醇溶解，加入硅藻土拌匀，晾干。经95%乙醇回流提取，提取液减压回收乙醇得到1.75Kg乙醇提取物。乙醇提取物分别用二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇萃取，成功获得250g二氯甲烷萃取物（B-1）、850g乙酸乙酯萃取物（B-2）和444克甲醇萃取物（B-3）。其中二氯甲烷萃取层经硅胶柱色谱，以石油醚/丙酮梯度洗脱制备得到单体化合物loureirinA（B-1-1）。
（2）体外免疫磁珠分离野生型小鼠脾脏CD4+T细胞，3种萃取物设剂量为1μg/ml、10μg/ml、40μg/ml、70μg/ml和100μg/ml与ConA共育，1种单体化合物设剂量0.1μM、1μM、10μM、30μM和50μM与ConA共育，各给药组中ConA终浓度为5μg/ml，同时设空白对照组（培养液）、阴性对照组（培养液+细胞+5.0μg/mlConA）和阳性对照组（培养液+细胞+1.0μg/ml环孢素A）细胞给药后继续培养48h后MTT法检测CD4+T细胞的增殖情况。细胞增殖率=[（各加药组吸光度-空白对照组吸光度）/（阴性对照组吸光度-空白对照组吸光度）]×100%。
（3）通过自由饮用2.5％DSS的方式诱导小鼠炎症性肠病，将小鼠随机分为空白组、IBD组、龙血竭低浓度组（B-2-100mg/kg）、中浓度组（B-2-200mg/kg）和高浓度组（B-2-400mg/kg），从饮用DSS的第1天开始到第8天用不同浓度龙血竭灌胃，第3天注射绵羊红细胞（SRBC），在饮用DSS的第8天处死小鼠，制备脾细胞悬液，加入补体和绵羊红细胞悬液，酶标仪检测313nm波长处的吸光度值（OD值）。
（4）按照（3）中的方法分组和处理小鼠，在实验进程中，每天记录小鼠的情况及不同时间的疾病活动指数（diseaseactivityindex，DAI）；在饮用DSS的第8天处死小鼠，分离结肠组织，HE染色观察炎症浸润情况并进行组织学损伤指数（histologicalindex，HI）评分。
（5）流式细胞术（FCM）检测小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中CD4+IFN-γ+T细胞、CD4+IL-4+T细胞和CD19+B细胞的比例。
结果：
（1）从云南血竭中，利用95%乙醇和不同极性溶剂萃取分别获得二氯甲烷萃取物（B-1）、乙酸乙酯萃取物（B-2）、甲醇萃取物（B-3）和单体化合物loureirinA（B-1-1）。
（2）在体外ConA介导的小鼠脾脏CD4+T细胞增殖的体系中，B-1、B-2、B-3和B-1-1对ConA刺激的小鼠脾脏CD4+T细胞的增殖均有不同程度的抑制作用。其中B-1在40μg/mL时表现出对细胞具有显著的抑制作用，同时不影响细胞的存活率，高浓度时（70μg/mL和100μg/mL）虽然可以显著抑制CD4+T细胞的增殖，但同时毒性作用也较大。从B-1中靶向分离纯化得到主成分B-1-1浓度在1μM时细胞的增殖率为60.27±4.90%，50μM时细胞的增殖率为30.96±9.34%，且在效应浓度下对CD4+T细胞的存活率无显著影响。B-2在1μg/mL时即表现出显著的抑制作用，且抑制作用具有浓度依赖效应。几乎各个浓度的B-2对细胞的存活率均有一定的影响，但高浓度时的毒性作用小于B-1。B-3对ConA介导的小鼠脾脏CD4+T细胞增殖的抑制作用不明显，细胞的增殖仍比较旺盛，仅在高浓度70μg/mL和100μg/mL时有较弱的抑制作用。综合上述结果分析，我们选择B-2进行后续的体内实验。
（3）在溶血空斑实验中，龙血竭乙酸乙酯萃取物B-2不同浓度组，抗体水平均明显高于IBD组，结果提示B-2能有效地促进SRBC特异性抗体的生成。
（4）根据DAI评分标准，IBD组、B-2-100mg/kg治疗组、B-2-200mg/kg治疗组和B-2-400mg/kg治疗组小鼠自造模第3天起DAI分数均持续增加，但治疗组小鼠DAI指数在对应的时间点都低于IBD组。造模第8天，较对照组，B-2处理组小鼠结肠充血、肿胀和缩短的程度，以及病理评分均减轻或明显减轻（p＜0.05），表明B-2能有效延缓小鼠IBD进程。
（5）FCM结果显示，IBD组小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中的CD4+IFN-γ+T细胞的比例明显降低（p＜0.05），经过B-2-100mg/kg治疗后，小鼠脾脏中CD4+IFN-γ+T细胞的比例有升高趋势，B-2-200mg/kg治疗组小鼠脾脏中CD4+IFN-γ+T细胞的比例与IBD组相比明显增高，有显著性差异（p＜0.05），B-2-400mg/kg治疗组小鼠脾脏中CD4+IFN-γ+T细胞的比例又呈现下降趋势，肠系膜淋巴结中CD4+IFN-γ+T细胞的比例变化趋势与脾脏相似。
（6）FCM结果显示，IBD组小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中CD4+IL-4+T细胞的比例明显升高（p＜0.05），B-2-200mg/kg治疗组小鼠脾脏中CD4+IL-4+T细胞的比例与IBD组相比明显降低，有显著性差异（p＜0.01），B-2-400mg/kg治疗组小鼠脾脏中CD4+IL-4+T细胞的比例又呈现升高的趋势。相比于NC组小鼠，IBD组小鼠肠系膜淋巴结中CD4+IL-4+T细胞的比例明显升高（p＜0.01）。与IBD组相比，各浓度治疗组小鼠肠系膜淋巴结中CD4+IL-4+T细胞的比例均有显著性降低（p＜0.01，p＜0.001）。
（7）IBD组小鼠脾脏中CD19+B细胞的比例明显降低（p＜0.05），经过B-2-100mg/kg和B-2-200mg/kg治疗后，小鼠脾脏中CD19+B细胞的比例有明显地回升（p＜0.05，p＜0.01）。肠系膜淋巴结中CD19+B细胞的比例变化趋势与脾脏中相反，IBD组小鼠肠系膜淋巴结中CD19+B细胞的比例与NC组小鼠相比出现了增高的现象，变化有显著性差异（p＜0.01），经过不同浓度B-2的治疗，小鼠肠系膜淋巴结中CD19+B细胞的比例均出现了回落。
结论：
（1）成功制备云南血竭二氯甲烷萃取物（B-1）、乙酸乙酯萃取物（B-2）甲醇萃取物（B-3）和单体化合物loureirinA（B-1-1），体外实验证实对CD4+T细胞的增殖均有不同程度的抑制作用和毒性作用。
（2）各浓度B-2均可以有效减轻小鼠IBD的疾病程度，与促进CD4+IFN-γ+T细胞增殖、抑制CD4+IL-4+T细胞增殖和增强机体的体液免疫有关。