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用纯化的猪流感病毒（SIV）免疫BALB/C小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经间接ELISA和红细胞凝集抑制实验筛选，经过4次有限稀释法克隆，获得了1株能稳定分泌抗猪流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为5B4。经鉴定该单抗为IgG1亚类，杂交瘤细胞的平均染色体数目为96.8条，杂交瘤细胞培养上清及小鼠腹水单克隆抗体的ELISA效价分别为1:1024和1:51200。5B4株单克隆抗体与猪伪狂犬病毒、猪繁殖-呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒均不发生交叉反应，显示良好的特异性。连续培养21代，5B4杂交瘤细胞株能稳定分泌抗体。利用5B4杂交瘤细胞株的小鼠腹水单克隆抗体建立了检测SIV的双夹心ELISA的检测方法。经测定，单克隆抗体的最适包被浓度为2.95μg/ml，兔抗SIV 高免血清的最适工作浓度为1:800。其检测灵敏度为2.43μg/ml。用该方法对自然发病死亡猪的气管、支气管、肺、扁桃体、淋巴结等的组织研磨物进行检测，结果发现在气管和支气管检出率最高，同时对于发病猪的鼻腔拭子擦拭物，不经特殊处理就可以用建立的双夹心ELISA检测出SIV。并且与病毒分离对比试验有较高的符合率。双夹心ELISA的建立为生产上提供了一种更简单、快速、灵敏、高效、实用的SIV检测方法。